实时定量pcr中的internal是怎么回事
各位大牛,最近准备做血清样本中病毒的实时定量PCR,有别人给的实验方法和引物,但是发现protocol中,要检测同一个病毒序列上的不同区的两个片段,分别是FAM-TAMRA 和VIC-TAMRA 两条标记的探针。问了以前做定量PCR的人,说是internal对照。
问题1:始终不明白检测一条就可以证明该种病毒了啊,为什么要检测两条片段?
问题2:两条片段该用那一条算作是定量计算呢?
相关于internal的这个问题,看到一篇文献中在试验方法中是这样写的:
For the HDV internal control, a partial HDV sequence was internally modified and amplified by use of qRT-PCR to produce synthetic DNA, and the product was subcloned. For detection of the internal control, the probe was 5'-HEX– GCGATGGTGACTTTGTGGATAGTATCCTCA-3'-TAMRA. For the positive control for HDV, a region corresponding to nt 883–1265 was amplified, subcloned, and purified.
请问,这个文章中的internal control 又是什么意思,是要clone 制备标准品么?在同一个反应管中也要检测两个片段么?
还有一个问题,我做了几次实验,发现,目的片段,含量极低,第40个循环的时候曲线才刚刚抬头,我把循环数增加到55,才能看到完整的曲线,同时设有阴性对照和阳性对照,阴性对照什么都没有,想问一下,这样直接增加循环数,看到在40个循环看到起峰,目的片段,算是阳性么?
谢谢。