腺相关病毒从引物设计，病毒包装与浓缩及感染个体

1 背景知识介绍

1.1 腺相关病毒简介

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 在人类和小鼠中，AAV感染可以介导外源基因发生低频率（不高于2%）的定向整合，插入的位置一般在19号染色体短臂（人类基因组中的AAV S1和鼠中的ROSA26位点）。病毒基因组在不发生整合的情况下在被感染细胞内形成伴随体，可以随染色体复制。因此无论外源DNA是否被整合，都可以在细胞核内稳定复制和转录，产并生RNA和蛋白产物。

重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，这些特点使重组AAV成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。

腺相关病毒( AAV ) 是感染人类和其他一些灵长类动物的小病毒。它们属于依赖细小病毒属，而后者又属于细小病毒科。它们是小型 (20 nm )复制缺陷型无包膜病毒，具有大约 4.8 kb的线性单链DNA (ssDNA) 基因组。

目前尚不知道 AAV 会导致疾病。病毒引起非常温和的免疫反应。几个附加功能使 AAV 成为创建用于基因治疗的病毒载体和创建同基因人类疾病模型的有吸引力的候选者。使用 AAV 的基因治疗载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并在染色体外状态下持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中。然而，在天然病毒中，病毒携带的基因确实会整合到宿主基因组中。集成对于某些应用程序可能很重要，但也可能产生不良后果。最近使用AAV 进行视网膜基因治疗的人体临床试验显示出前景。

腺相关病毒 (AAV) 以前被认为是腺病毒制剂中的污染物，在 1960 年代，匹兹堡的 Bob Atchison 和NIH的Wallace Rowe的实验室首次将其鉴定为依赖细小病毒。随后对人类的血清学研究表明，尽管 AAV 存在于感染了辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）的人中，但 AAV 本身并没有引起任何疾病。

由于许多特征，野生型 AAV 引起了基因治疗研究人员的极大兴趣。其中最主要的是该病毒明显缺乏致病性。它还可以感染非分裂细胞，并具有在人类染色体 19的特定位点（称为 AAVS1）稳定整合到宿主细胞基因组中的能力。这一特征使其比逆转录病毒更具可预测性，逆转录病毒具有随机插入和诱变的威胁，有时会引发癌症. AAV 基因组最常整合到上述位点，而随机整合到基因组中的频率可以忽略不计。然而，作为基因治疗载体的 AAV 的开发已经通过从载体的DNA中去除rep和cap消除了这种整合能力。在单链载体 DNA 被宿主细胞 DNA 聚合酶复合物转化为双链后，将所需基因与驱动基因转录的启动子一起插入反向末端重复(ITR) 之间，这有助于在细胞核中形成多联体脱氧核糖核酸。基于 AAV 的基因治疗载体形成游离型多联体在宿主细胞核中。在非分裂细胞中，这些多联体在宿主细胞的生命周期内保持完整。在分裂细胞中，AAV DNA 通过细胞分裂丢失，因为游离型 DNA 不与宿主细胞 DNA 一起复制。AAV DNA 随机整合到宿主基因组中是可检测的，但发生频率非常低。AAV 还具有非常低的免疫原性，似乎仅限于产生中和抗体，而它们不会诱导明确定义的细胞毒性反应。这一特征以及感染静止细胞的能力在腺病毒作为人类基因治疗的载体。

使用病毒确实存在一些缺点。该载体的克隆能力相对有限，大多数治疗基因需要完全替换病毒的 4.8 千碱基基因组。因此，大基因不适合在标准 AAV 载体中使用。目前正在探索克服有限编码能力的方案。两个基因组的 AAV ITR 可以退火形成头对尾多联体，几乎使载体的容量增加一倍。剪接位点的插入允许从转录本中移除 ITR。

由于 AAV 的特殊基因治疗优势，研究人员创造了一种称为自我互补腺相关病毒 (scAAV)的 AAV 的改变版本。AAV 包装单链 DNA 并且必须等待其第二链合成，而 scAAV 包装两个较短的相互互补的链。通过避免第二链合成，scAAV 可以更快地表达，但需要注意的是，scAAV 只能编码 AAV 已经有限容量的一半。​最近的报告表明，scAAV 载体比单链腺病毒载体更具有免疫原性，可诱导更强的细胞毒性 T 淋巴细胞活化。

由野生型感染引起的体液免疫被认为是常见的。相关的中和活性限制了最常用的血清型 AAV2 在某些应用中的有用性。因此，正在进行的大多数临床试验都涉及将 AAV2 输送到大脑中，大脑是一种相对免疫特权较高的器官。在大脑中，AAV2 具有很强的神经元特异性。

1.2 腺相关病毒结构

1.2.1 基因组学、转录组学和蛋白质组学

AAV 基因组由单链脱氧核糖核酸 (ssDNA ) 构成，无论是正感还是负感，其长度约为 4.7 kb。基因组包含 DNA 链两端的 ITR，以及两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。前者由编码 AAV 生命周期所需的 Rep 蛋白的四个重叠基因组成，后者包含衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：VP1、VP2 和 VP3，它们相互作用形成具有二十面体对称性的衣壳。

1.2.2 ITR 序列

反向末端重复(ITR) 序列各包含 145 个碱基。它们之所以如此命名是因为它们的对称性，这被证明是 AAV 基因组有效增殖所必需的。赋予它们这种特性的这些序列的特征是它们形成发夹的能力，这有助于所谓的自引发，允许第二条 DNA 链的不依赖于引发酶的合成。ITR 也被证明是 AAV DNA 整合到宿主细胞基因组（人类第 19 条染色体）和从中拯救所必需的，以及 AAV DNA 的有效封装与生成相结合一个完全组装的，抗脱氧核糖核酸酶的 AAV 颗粒。

在基因治疗方面，ITR 似乎是治疗基因旁边唯一需要的顺式序列：结构（ cap）和包装（rep）蛋白可以反式传递。在这种假设下，建立了许多有效生产含有报告基因或治疗基因的重组 AAV (rAAV) 载体的方法。然而，也有报道指出，ITR 并不是独联体中有效复制和封装所需的唯一元素。一些研究小组在rep的编码序列中确定了一个序列，称为cis-acting Rep-dependent element (CARE)基因。当存在于 cis 中时，CARE 被证明可以增加复制和封装。

1.2.3 rep基因和 Rep 蛋白

在基因组的“左侧”有两个称为 p5 和 p19 的启动子，从中可以产生两个不同长度的重叠信使核糖核酸 ( mRNA )。每一个都包含一个内含子，可以剪接或不剪接。鉴于这些可能性，可以合成四种不同的 mRNA，从而合成四种具有重叠序列的不同 Rep 蛋白。它们的名称以千道尔顿(kDa)为单位描述它们的大小：Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40。 Rep78 和 68 可以特异性结合发夹由 ITR 在自启动行为中形成，并在发夹内的特定区域（指定的终端解析位点）处切割。它们也被证明对于 AAV 基因组的 AAVS1 特异性整合是必需的。所有四种 Rep 蛋白均显示结合ATP并具有解旋酶活性。还表明它们上调了 p40 启动子（下文提到）的转录，但下调了 p5 和 p19 启动子。

1.2.4 cap基因和VP蛋白

阳性 AAV 基因组的右侧编码三种衣壳蛋白 VP1、VP2 和 VP3 的重叠序列，它们从一个启动子开始，称为 p40。这些蛋白质的分子量分别为 87、72 和 62 千道尔顿。[40] AAV 衣壳由 VP1、VP2 和 VP3 的混合物组成，共有 60 个单体以1:1:10 的比例呈二十面体对称排列，空质量约为 3.8 MDa。 VP3 蛋白 的晶体结构由 Xie、Bue等人确定。

AAV2 衣壳，显示为带状图，为清楚起见隐藏了后半部分。中心显示一个五重对称轴。

cap基因产生一种额外的非结构蛋白，称为装配激活蛋白 (AAP)。这种蛋白质由 ORF2 产生，对衣壳组装过程至关重要。这种蛋白质在组装过程中的确切功能及其结构迄今尚未得到解决。

所有三个 VPs 都是从一个 mRNA 翻译而来的。合成此 mRNA 后，它可以以两种不同的方式剪接：可以切除更长或更短的内含子，从而形成两个 mRNA 池：一个 2.3 kb 和一个 2.6 kb 长的 mRNA 池。通常，特别是在存在腺病毒的情况下，较长的内含子是首选，因此 2.3-kb 长的 mRNA 代表了所谓的“主要剪接”。在这种形式中，第一个AUG 密码子VP1 蛋白的合成起始点被切断，导致 VP1 蛋白合成的总体水平降低。保留在主要剪接中的第一个 AUG 密码子是 VP3 蛋白的起始密码子。然而，在同一开放阅读框中，该密码子的上游是一个 ACG 序列（编码苏氨酸），该序列被最佳Kozak 上下文包围。这有助于 VP2 蛋白的低水平合成，VP2 蛋白实际上是具有额外 N 末端残基的 VP3 蛋白，VP1 也是如此。

由于优选剪接较大的内含子，并且由于在主要剪接中 ACG 密码子是一个弱得多的翻译起始信号，因此AAV 结构蛋白在体内合成的比例约为1:1:20，即与成熟的病毒颗粒相同。VP1 蛋白 N 末端的独特片段显示具有磷脂酶A2 (PLA2) 活性，这可能是从晚期内体释放 AAV 颗粒所必需的。穆拉利达尔等人，报道VP2和VP3对于正确的病毒粒子组装至关重要。然而，最近，Warrington等人。表明VP2对于完整的病毒颗粒形成和有效的感染性是不必要的，并且还表明VP2可以容忍其N末端的大量插入，而VP1不能，可能是因为PLA2结构域的存在。

图1 两个腺病毒颗粒被许多较小的腺相关病毒包围（负染色电子显微镜，放大率约 200,000 倍）

1.3 分类、血清型、受体和天然向性

2013 年国际病毒分类委员会认可了两种 AAV ：腺相关依赖细小病毒 A（以前称为 AAV-1、-2、-3 和 -4）和腺相关依赖细小病毒 B（以前称为 AAV-5）。

直到 1990 年代，几乎所有 AAV 生物学都使用 AAV 血清型 2 进行研究。然而，AAV 在人类和其他灵长类动物中非常普遍，并且已经从各种组织样本中分离出几种血清型。在人类细胞中发现了血清型 2、3、5 和 6，在非人类灵长类动物样本中发现了 AAV 血清型 1、4 和 7-11。截至 2006 年，已经描述了 11 种 AAV血清型，2004 年第 11种。 AAV 衣壳蛋白包含 12 个高变表面区域，大部分变异发生在近端的三峰，但细小病毒基因组一般呈现高度保守跨血清型的复制和结构基因。所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。组织特异性由衣壳血清型决定，AAV 载体的假型化以改变其向性范围可能对其在治疗中的使用很重要。

1.3.1 血清型 2

迄今为止，血清型 2 (AAV2) 已得到最广泛的检查。AAV2 呈现出对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞的自然趋向性。

已经描述了 AAV2 的三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、Vβ5 整合素和成纤维细胞生长因子受体 1 (FGFR-1)。第一个作为主要受体起作用，而后两个具有共受体活性，使 AAV 通过受体介导的内吞作用进入细胞。[65] [66] [67] 这些研究结果受到邱、韩达等人的质疑。[68] HSPG 作为主要受体发挥作用，尽管其在细胞外基质中的丰度可以清除 AAV 颗粒并损害感染效率。

研究表明，该病毒的血清型 2 (AAV-2) 显然可以杀死癌细胞，而不会伤害健康细胞。“我们的研究结果表明，感染大多数人群但没有已知不良影响的 2 型腺相关病毒可以杀死多种类型的癌细胞，但对健康细胞没有影响，”教授Craig Meyers [70]说2005 年在宾夕法尼亚州宾夕法尼亚州立大学医学院获得免疫学和微生物学博士学位。 这可能会导致一种新的抗癌剂。

1.3.2 其他血清型

尽管 AAV2 是各种基于 AAV 的研究中最流行的血清型，但已表明其他血清型可以更有效地作为基因传递载体。例如，AAV6 在感染气道上皮细胞方面表现得更好， AAV7 具有非常高的鼠骨骼肌细胞转导率（类似于 AAV1 和 AAV5），AAV8 在转导肝细胞方面表现出色和 AAV1 和 5 被证明在将基因递送到血管内皮细胞方面非常有效。在大脑中，大多数 AAV 血清型显示神经元嗜性，而 AAV5 还转导星形胶质细胞。AAV6，AAV1 和 AAV2 的杂交体，也显示出比 AAV2 更低的免疫原性。

血清型可以在它们所结合的受体方面有所不同。例如，AAV4 和 AAV5 转导可以被可溶性唾液酸（每种血清型的不同形式）抑制，并且显示 AAV5 通过血小板衍生的生长因子受体进入细胞。

1.3.3 合成血清型

为了临床和研究目的，已经做出了许多努力来设计和改进新的 AAV 变体。此类修饰包括针对特定组织的新趋向性，以及修饰表面残基以逃避免疫系统的检测。除了选择特定的重组 AAV菌株（rAAV）针对特定细胞，研究人员还探索了 AAV 假型，即创建某些 AAV 菌株的杂交体以接近更精细的目标的做法。杂种是通过从一种菌株中提取衣壳和从另一种菌株中提取基因组而产生的。例如，涉及 AAV2/5（与 AAV2 基因组和 AAV5 衣壳的杂交体）的研究能够在脑细胞中实现比 AAV2 未杂交时更高的准确性和范围。研究人员继续通过创建带有混合衣壳的菌株来试验假型。AAV-DJ 具有来自八种不同 AAV 菌株的混合衣壳；因此，它可以感染身体许多区域的不同细胞，这是单一 AAV 菌株具有有限趋向性所不具备的特性。设计和改进新的 AAV 变体的其他努力涉及病毒变体的祖先重建，以生成具有增强特性的新载体，用于临床应用和 AAV 生物学研究。

4 免疫学

AAV 对基因治疗师特别感兴趣，因为它在人类中诱导免疫反应的能力明显有限，这一因素应该对载体转导效率产生积极影响，同时降低任何免疫相关病理的风险。

AAV 不被认为在疾病中具有任何已知的作用。

然而，宿主免疫系统反应和免疫耐受降低了 AAV 介导的基因治疗的功效。已显示宿主免疫反应对 AAV 载体、转导的细胞和转导的蛋白质有反应。免疫反应可分为两类：先天性和适应性，后者分为体液和细胞介导。

1.4.1 先天（Innate）

对 AAV 载体的先天免疫反应已在动物模型中进行了表征。小鼠静脉内给药会导致促炎细胞因子的短暂产生和一些嗜中性粒细胞和其他白细胞浸润到肝脏中，这似乎隔离了大部分注射的病毒颗粒。可溶性因子水平和细胞浸润似乎都在六小时内恢复到基线。相比之下，更具攻击性的病毒会产生持续 24 小时或更长时间的先天反应。

体内研究表明，AAV 载体与 Toll 样受体 (TLR)9 和 TLR2-MyD88 通路相互作用，通过刺激干扰素的产生来触发先天免疫反应。研究表明，缺乏 TLR9 的小鼠更容易接受 AAV 治疗，并表现出更高水平的转基因表达。

1.4.2 体液（Humoral）

由于先前的自然感染，许多人已经存在针对 AAV 的中和抗体 (NAb)，这可能会严重阻碍其在基因治疗中的应用。尽管 AAV 在野生型和合成变体中变化很大，但抗体识别位点可能在进化上是保守的。已知该病毒可在动物模型和人群中激发强大的体液免疫，其中高达 80% 的个体被认为对 AAV2呈血清反应阳性。已知抗体具有中和作用，对于基因治疗应用，这些确实会通过某些给药途径影响载体转导效率。除了持续的 AAV 特异性抗体水平外，动物的初免增强研究和临床试验似乎都表明 B 细胞记忆力也很强。在血清反应阳性的人类中，AAV2 的循环IgG抗体似乎主要由 IgG1 和 IgG2 亚类组成，几乎没有或没有 IgG3 或 IgG4 存在。

1.4.3 细胞介导

细胞介导的对病毒和载体的反应特征很差，直到 2005 年在文献中基本上被忽略了。使用基于 AAV2 的载体治疗血友病 B 的临床试验似乎表明，靶向破坏可能会出现转导细胞。结合显示CD8+ T 细胞可以在体外识别 AAV 衣壳元素的数据，似乎可能存在对 AAV 载体的细胞毒性 T 淋巴细胞反应。细胞毒性反应意味着CD4+ T 辅助细胞参与了对 AAV 的反应和体外反应来自人类研究的数据表明，该病毒确实可能会诱导这种反应，包括 Th1 和 Th2 记忆反应。已在 AAV 衣壳蛋白 VP1 中鉴定出许多候选 T 细胞刺激表位，如果将病毒用作基因治疗的载体，这可能是修饰衣壳的有吸引力的目标。

1.5 感染周期

AAV 感染周期有几个步骤，从感染细胞到产生新的感染性颗粒：

1. 附着在细胞膜上；2. 受体介导的内吞作用；3. 内体转运；4. 逃离晚期内体或溶酶体；5. 转移到细胞核；6. 脱衣；7. AAV基因组的双链DNA复制形式的形成；8. rep基因的表达；9. 基因组复制；10. cap基因的表达，后代ssDNA颗粒的合成；11. 完整病毒体的组装；12. 从受感染的细胞中释放出来。

图2 慢病毒和腺相关病毒比较

Cited：Using Lentiviral Vectors as Delivery Vehicles for Gene Therapy

（图3：AAV生命周期。AAV在腺病毒合并感染的情况下可产生性感染。其特征是基因组复制、病毒基因表达和病毒粒子产生。在没有腺病毒的情况下，AAV可以通过整合到染色体19 (AAVS1)建立潜伏期。潜伏的AAV基因组可以在腺病毒的重复感染下被拯救和复制。AAV生命周期的两个阶段都受AAV基因组和AAV、腺病毒和宿主蛋白之间复杂的相互作用的调节 Cited: Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors）

2 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）引物设计

2.1  腺相关病毒sgRNA引物的设计

2.2 腺相关病毒载体简介

本次所构建的腺相关病毒（AAV）设计到重组质粒saCas9-sgRNA-AAV（数量：1）和包装质粒AAV Helper-pDGM6 1和AAV9（数量：2）。特别注意：3个质粒均是氨苄（AMP^r）抗性，质粒转化过程中使用DH5α。saCas9-sgRNA-AAV遵循NNG的PAM motif进行sgRNA设计。

包装质粒1：AAV Helper-pDGM6

包装质粒2：AAV9

重组质粒：saCas9-sgRNA-AAV（酶切位点：BsaⅠ）

 saCas9-sgRNA-AAV

saCas9-sgRNA-AAV酶切位点：BsaⅠ，切开以后上游形成的粘性末端碱基F-“CACC”，下游形成的粘性末端碱基R-“CAAA”。

因此我们在设计saCas9-sgRNA-AAV的sgRNA引物的时候，需要在上游5’端加上 “CACC”，下游5端’添加“CAAA”。

2.3 sgRNA引物设计网页选择CRISPOR

点击连接可直接进入sgRNA引物设计网页（http://crispor.tefor.net/）。

2.3.1 CRISPOR简介

CRISPOR网站运行稳定，在设计sgRNA的时候非常方便，当然也存在其它的网站，同时每个人的使用习惯不一样。在此，我们推荐使用CRISPOR网站进行sgRNA的设计，现在我们就对CRISPOR的基本知识进行简单介绍。

首先，我们对我们粘贴的序列命名，这有利后期一目了然的知道设计的sgRNA属于哪个基因，当然，这是不必须的，可根据自己的习惯是否命名；接着，是在基因序列对话框中输入碱基序列（跨外显子，以便达到更好的对靶基因的knockout：KO）；其次，选择本次研究或者说是基因序列对应的物种，这是很关键的选择；再者是针对质粒选择在step3选择合适的质粒和对应的PAM motif，本次的saCas9-sgRNA-AAV使用的是NNG motif，在这里选择“20bp-NNG（A/G）（A/G）T- Cas9. Aureus with 20bp-guide”

通过上述5 Steps，即可提交（submit）。

在此我们简单插一下，怎么选择基因的碱基对。淡然选择基因不同剪切体的共有序列对位把对象，非常重要。但是我们为了达到更好的敲除/低效果，我们会针对共有序列的基础之上，对基因分成“前-中-后”，三段设计sgRNA。在此我们以mouse GPX5为例。

Ø Gpx5 剪切体1信息

可变剪接体以外显子和CDS相关信息：

Ø Gpx5 剪切体2信息

• 选择设计sgRNA的Gpx5位置及对应序列：

Ø 选择设计的sgRNA的Gpx5序列与对应的CDS区域blast：

• 2.3.2 Gpx5 AAV sgRNA1-3利用CRISPOR设计引物
• 2.3.2.1 录入信息

设计结果未发现合适PAM (NNGRRT) motif，这里就要适当的延长sgRNA1的设计区域的碱基序列（1-180bp）。

点击“Cloning/ PCR primers”获得sgRNA-F/R oligo

2.3.2.2组装软件模拟组装sgRNA

F: CACCcatcttcatcttttccggcct

R: AAACaggccggaaaagatgaagatg

3 Snapgene sgRNA退火和克隆

3.1 获得F和R利用Snapgene进行模拟退火

​（1）打开克隆所用的质粒saCas9-sgRNA-AAV在查看序列模式下，选中酶切位点：

（2）粘贴/键入设计sgRNA引物的序列

（3）引物的退火：“行动-退火寡核苷酸链”得到下边的界面：

（4）将获得sgRNA序列填充到对应的框中，并命名；

（5）点击上图退火，即可得到下图：

（6）退火引物模拟克隆至saCas9-sgRNA-AAV：“行动-限制和插入片段克隆-插入片段”

（ 通过snapgene模拟克隆，主要是检测目的片段是否能够完全与载体（saCas9-sgRNA-AAV）进行连接。）

同理设计Gpx5-sgRNA2/3

Gpx5-sgRNA2

F2: CACCCTTTCCTGCATACTGCTTGAA

R2: AAACTTCAAGCAGTATGCAGGAAAG

Gpx5-sgRNA3

F3: CACCAACTTCCAGCTTTTTGCAAAA

R3: AAACTTTTGCAAAAAGCTGGAAGTT

3.2 退火加样体系

3.2.1 sgRNA PCR退火程序

95℃ 10min→85℃1min→75℃ 1min→65℃ 1min→55℃ 1min→55℃ 1min→45℃ 1min→35℃ 1min→ 25 ℃ 1min→15℃ 1min→10℃ 1min→8℃ 1min→4℃ 1h

3.2.3 sgRNAPCR退火

95℃ 10min，85℃ 1min，75℃ 1min，65℃ 1min，55℃ 1min，45℃ 1min，35℃ 1min，25℃ 1min，15℃ 1min，10℃ 1min，8℃ 1min，4℃ 保存。（备注：本实验室使用PCR仪器进行AAV-引物退火）

3.2.4 sgRNAPCR退火

98℃10min，70℃10min，关闭PCR仪器，待oligos自然冷却。

3.2.5 sgRNA水浴锅退火

将水浴锅加热至100℃，100℃作用10min，然后关闭水浴锅电源，待其自然冷却。

​（我一般会将3.4和3.5的退火产物混合着用，这样子成功的概率会大很多）

3.3 saCas9-sgRNA-AAV酶切

3.3.1 酶切体系

3.3.2 退火后的sgRNA连接

3.4 重组质粒（Recombinant Vector）转化

（1）将连接产物与DH5α，充分混匀，冰浴30 min；

（2）将上述产物，置于42℃水浴锅中，热激90-120 sec；

（3）将上述产物，转移至冰浴中，在此冷激2-5 min；

（4）加入500μL无抗培养基，于37℃，220rpm，作用1小时左右；

（5）将上述菌液离心收集沉淀，并用大概80μL培养基重悬沉淀，涂布至含有氨苄（AMP^r）抗性的固体培养基；

（6）于37℃恒温超时培养箱中正置15 min，然后倒扣过夜，大概12-16 h即可看到单克隆菌落。

3.5 单克隆菌落选择和测序

（1）选择单一的菌落，并在培养皿各个部位挑取3个（左右）菌落，进行培养，1 ml培养基中含有AMP^r抗生素；

（2）挑取的菌落，于37℃，220rpm，作用4小时左右；即可送测序；

（3）saCas9-sgRNA-AAV使用生工通用人源U6启动子引物 （GACTATCATATGCTTACCGT）进行测序。

​4 AAV（Adeno-associated virus）病毒的包装

4.1  AAV 病毒包装

AAV病毒的包装，主要涉及到两个包装质粒（AAV Helper-pDGM6 和AAV9）和一个重组质粒saCas9-sgRNA-AAV。

与慢病毒（lentivirus）不同的是，AAV需要大量的质粒，且比例也不相同。具体情况我们以10cm的293T为例：

Table1 腺病毒的包装质粒混比

4.2 AAV 病毒收集

（1）48H可收集一次病毒液；

（2）72H可收集一次病毒液或者在92H收集第二次病毒液，中途记得添加适当的培养基（5ml）。

4.3 AAV纯化与浓缩

（1）配制不同浓度的碘克沙醇： 40%(w/v)、20%(w/v)、10%(w/v)和5%(w/v)；

表2 种梯度碘克沙醇溶液的配制比例

（2） 从超速离心管底部依次缓慢往上添加：3 mL 40%(w/v)、3 mL 20%(w/v)、3 mL 10%(w/v)和2.5 mL 5%(w/v)（很好理解越重的越在下边）；

（3）将处理好的病毒液加入到最上层；

（4）配平后超速，18℃、100, 000 rpm、2.5h离心。

（5）离心完毕后，将超滤管底用针头刺破，收集腺相关病毒所在层至15mL管中；

（6）转移后的浓缩病毒采用1 ml（或者根据需求进行重悬） PBS充分重悬，放置于4℃短期保存，尽快使用；

（备注：现在已经有现成的腺病毒浓缩液试剂盒，可以直接购买，非常方便）

4.4 AAV感染个体

AAV感染动物模型，一般情况下1-2周能够将外源基因在活体内表达，从而起到研究该基因的功能机制。

表3 不同类型的病毒外源基因整合表达情况

表4 不同类型的病毒外源基因整合表达情况

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“夏洛蒂 · 勃朗特《简 · 爱》：假如你避免不了，就得去忍受。不能忍受生命中注定要忍受的事情，是软弱和愚蠢的表现。”！！！关注楼主GBhouse，如果有用，点赞+讨论是博主持续更新的动力！！！）