【求助帖】同一批样本的qPCR突然没有了趋势，求探讨原因！

事情是这样的，本入门狗在年前研究某药物A对细胞中某RNA的影响，以及用药物B治疗能缓解该RNA的升高的实验。前期进行了两次实验（不同样本），趋势都大致相同。

第一次实验：是在年前，用第一批样本做的qPCR，跑出来的结果是这样子的。

趋势和本入门狗要做的大致相同，即药物A能增加目的基因的表达，而用药物B治疗能缓解药物A的影响。

第二次实验：是过年回来后，用冻存的第二批样本做的qPCR，跑出来的结果和第一次大致类似。

而两次的曲线基本都是这个样子的：

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正当本入门狗志在必得的准备进行最后一次重复试验的时候，意外出现了！取第二次成功的样本在第二天，又进行一次实验时发现，它的趋势突然消失了！消失了！

而他的曲线也突然变成了这个样子。

随后本入门狗取了一份新的样品，重新进行实验，结果却发现，还是一样的情况：趋势还是没有了！

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以上就是惨案的全过程。本入门狗使用的是SYBR GREEN的20μL体系进行的荧光PCR。前后实验的材料基本一致，引物使用的是分装后的引物。

目前本入门狗总结了以下几个特点：

1.四次实验参考基因的起跳基本都是在12个循环，而目的基因的起跳基本都是在16个循环。

2,二次实验（趋势正确）和第三次实验（趋势错误）是同一批逆转录后的cDNA样本。

3.中途引物有用完，随后重新配置引物（原液是一样的），怀疑是引物的问题，但是重新配置引物后也还是没有趋势，而且如果是引物的问题，那为何基因的起跳循环并没有改变呢？

希望大家能给我点思路，随便扯扯也好啊！本入门狗想了两天，实在没想出哪里出了问题。在线等，挺急的。