【求助】棘手案例:Co-IP实战遇阻,求解!
最近在做拟南芥的蛋白互作时遇到问题,请教大家:
用拟南芥叶片液氮磨样,4度5000G离心5分后,用Pierce公司的Co-IP试剂盒做免疫共沉淀实验,完全按照说明书操作的,结果Control Gel(阴性对照组)中总是出现非特异性条带,样品组中的条带与Control Gel(阴性对照组)中的条带完全一样!按说阴性对照组里应该没有太明显的条带才对啊?但实际上Control Gel(阴性对照组)中的条带十分明显,就跟目的样品中的一个样,会不会是出厂时厂家把Control Gel装错了呢(感觉可能性不大)?尝试增加复合物的洗涤次数(到10次以上了)并且wash buffer 中有加入0.5%的triton X-100,都没有效果。而且样品也用Control Gel预处理了,都没能解决问题,阴性对照组的非特异性结合还是很强,这怎么办呢?急啊!!!


另外,抗体是兔抗血清,做Wb实验用过,特异性蛮好的。可以杂到43Kd的目的蛋白。
洗脱复合物的银染如下图:

问题:
1,如何减少阴性对照中的非特异性结合?
2,看到的两个主带该不会是把抗体洗脱下来了吧?
3,另外,洗脱的复合物中应该有诱饵蛋白的存在吗?我好像没有检测到,从银染图中没看到明显的43Kd目的带呦!
4,我有点怀疑这个53 Kd左右的带是不是 Rubisco蛋白,如果是的话,怎么降低它的干扰?
先谢谢各位!
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 4149