【资源】一个完美的推理过程：ENTPD5与蛋白质N端糖质化和pten通路相关增殖两三事~

最近非常有幸看了一篇很好的文章，很享受阅读它的过程，于是做了一点点读书笔记，希望可以跟大家分享一下。

总结：王晓东及其团队在《The ER UDPase ENTPD5 Promotes Protein N-Glycosylation, the Warburg Effect, and Proliferation in the PTEN Pathway》一文中，发现PTEN的缺失，使得PI3K的表达缺乏相应的拮抗，于是PIP3大量积聚，从而使AKT活性明显升高，细胞翻译的水平升高，明显生长与增殖。ENTPD5，是内质网上的一种酶，AKT的活化，可以使这种酶高表达。它通过将UDP水解成UMP，促使蛋白N端糖基化并在ER中进行折叠。其中糖基化的
这一过程靠一个ATP-AMP水解环完成：UMP被UMP激酶CMPK1磷酸化为UDP，这个过程中，ATP变成ADP，提供能量与磷酸根。UDP-糖在胞内生成，然后运输到ER中，这一过程需要交换出一分子的UMP。UDP-糖基中的糖基在ER中为糖蛋白糖基转移酶UGGT所识别，并转移到多肽链上，多肽链与葡萄糖的反复移除与连接，使得钙联结蛋白与多肽链的不断地结合与释放，直至完成蛋白质的折叠，而UDP又被ER内的ENTPD5 去磷酸化为UMP，再继续一个新的循环。过程中产生的ADP，再由腺苷酸激酶将两个ADP变成一个ATP与一个AMP，ATP再继续被利用。
受体酪氨酸激酶可以促进细胞生长与增殖，包括EGFR等，均为高度的糖基化。而ENTPD在这些受体酷氨酸激酶的糖基化过程中起关键作用。ENTPD5基因的敲除意味着酪氨酸激酶受体，包括EGFR、IGFRβ、Her-2/ErbB-2的低表达。与ER压力性标志BiP的出现。最后在人肿瘤细胞与动物模型上证实了上述发现。验证肿瘤细胞上pten的表达障碍导致的AKT活性升高，导致ENTPD5酶活性升高，促使蛋白质N端糖基化，导致受体酪氨酸激酶在肿瘤细胞上高表达，从而使得肿瘤细胞

背景：
1、PI3K（磷酸激酶）与PTEN（磷酸酶）作用相反，前者PIP2变成PIP3。PIP3的浓度升高可以活化AKT激酶，并最终促进细胞增殖与存活。在肿瘤细胞中AKT的异常活化常常可以观察到。
2、AKT的活化有两种结果，一个是磷酸化其下游包括rapamyci-sensitive mTORC1与4EBP1（翻译抑制因子），导致翻译加速。二是提高有氧酵解并合成更多为利于生长的生物大分子：使膜表面糖转运子表达升高，所以可以获得更多的糖，。
3、研究人员发现M2型丙酮酸激酶（PKM2）是这个过程背后的非常重要的代谢分子。对多种肿瘤细胞系的分析实验证实，PKM2是癌变组织中发现的唯一一种形式的丙酮酸激酶。当用成熟的M1型丙酮酸激酶替代肿瘤细胞中的 PKM2后，导致乳酸产量的下降和耗氧量的增加，这正好和Warburg效应相反。
4、UDP-glucose是蛋白质糖基化的底物。许多分泌蛋白与膜蛋白均为N端糖基化。受体酪氨酸激酶可以促进细胞生长与增殖，包括EGFR等，均为高度的糖基化，这些生长因子受体若是增加，意味着细胞生长增殖增加。大多数的糖基化发生在高尔基体上，而有两个已知的例外。其中一个就是发生在ER上的重新糖基化，核心聚糖上的第三与第二个葡萄糖被糖苷酶I和II修剪了后。
修剪与重糖基化by UDP-glucose：糖蛋白糖基转移酶UGGT产生可以为钙联结蛋白识别的单糖化的结构。葡萄糖的反复移除与连接，使得钙联结蛋白与多肽链的不断地结合与释放，直至完成蛋白质的折叠，并转运至高尔基体。
5、ENTPD5座落于ER上与preferred specificity for UDP这两点表明，这个酶，在UGGT催化的重新糖基化 for 钙联结蛋白介导的蛋白质折叠中起作用。
UDP在成对的糖被运到在位于N端糖基化蛋白上，由糖苷酶Ⅰ/Ⅱ修剪过的核心聚糖 生成。UDP-糖在胞内生成，然后运输到ER中，这是一种逆向转运，需要交换出一分子的UMP。然后UDP在这里水解成UMP，以防止终产物对UGGT的抑制反馈，并为逆向转运提供基质。UMP在胞质内被CMPK1重新磷酸化为UDP

结论：ENTPD5，是内质网上的一种酶，AKT的活化，可以这种酶的高表达。它可以通过将UDP水解成UMP，促使蛋白N端糖基化并在ER中进行折叠。在PTEN null 细胞中敲除ENTPD5导致ER压力并丢失生长因子受体，并使这种细胞无论是在体外还是体内均生长下降。它与胞嘧啶核苷单磷酸激酶1与腺苷酸激酶一起，组成一个ATP水解环，从而促使ATP向AMP转化。 迅速生成的肿瘤细胞的代谢调节不同于正常成熟组织，通过有氧糖酵解这种替代的代谢途径，使得其比其他细胞具有更高的效力吸收葡萄糖并制造足够的能量，因而获得快速生长的特性。
Results
1、在PTEN敲除 的MEFs中，ATP向AMP水解的活动升高。
2、在PTEN敲除 的MEFs中，正是ENTPD5这一ATP酶的活性升高，导致result1的出现，并且正是由于pten的敲除 ，引起这一酶活性的升高（FOXO家族可以抑制ENTPD5 mRNA的转录，但是，升高的AKT，酸酸化FOXO，促使后者离开胞核，进入胞浆）。
3、UMP或GMP是ATP水解过程中必不可少的辅助分子。
在纯化重组合成ENTPD5，并分别将它与ATP，ADP，CTP，CDP，GTP，GDP，UTP和UDP单独共孵育，出乎意料的是中，仅UDP与GDP可以被水解。于是作者发现，在ATP向AMP转化的过程中，存在一种小分子的辅助因子。
【一个是从特性中先确定了是核苷酸，然后再一一鉴别是哪种，最后发现U&G。为了确定是t,d or m，用了一种不能水解的构像，最后发现，UTPαS这种不能变成UMP的不行，所以，以此证实是UMP。】
4、UMP, ENTPD5, UMP/CMP激酶1， 腺苷酸激酶1组成了ATP-AMP水解环。
【UMP被UMP激酶变成了UDP，这个过程中，ATP变成ADP，提供能量与‘P’，而UDP又被ENTPD5变成了UMP，再继续一个新ATP向ADP转化的环---这个过程中，ATP不断地变成ADP。】所以，ENTPD5其实是个UDPase/GDPase?从【】中内容推测出，QFL里面的成分应该是腺苷酸激酶，只有他可以将两个ADP变成一个ATP与一个AMP，于是最终可以观察到的现象是ATP变成了AMP。
在这个实验中，例如第7页的左上段，将那部分需要鉴定的拿出来，然后分成不同的fraction，分别加入前面提到的Q?owthrough frac-tion中，然后，找出那个可以完成ATP-AMP的fraction，用western blotting（抗腺苷酸激酶1的抗体）来分析。
5、ER中，ENTPD5表达。（余见背景4）
6、ENTPD5的敲除向ER施压并致生长停滞。PI3K/AKT通路的活性上升后，细胞开发了一个与ER的通信系统，以满足对蛋白质折叠过程的高的需求。细胞可能是这样做的：上调ENTPD5，使UDP向UMP的转化增高，然后促使N端糖基化与蛋白折叠。因此，下调ENTPD5将增大ER的工作压力。另一方面，生长促进细胞膜上的受体 都是高度N端糖基化的，ENTPD5功能的丢失，将影响他们的折叠过程并导致细胞生成的最终停滞。
为了证实这一假设，作者基于PTEN null MEFs设计了数个细胞系，ENTPD5的表达可以加了Dox（Tet-suppreessor-controlled shRNA-targeting ENTPD5）就被敲除。
与表达有GFPshRNA的pten null MEFs相比，在培养基内加入DOX最终成功的敲除了ENTPD5的表达。于是，ER压力指标之一：GRP78/BiP被诱导产生了，而细胞的N-糖化基水平，经PHA印迹的衡量，下降了。
有趣的是，受体酪氨酸激酶，包括EGFR，Her-2/Erbb-2与I型胰岛素样生长因子受体IGF-IR在ENTPD5敲除后明显的下调。
为了证明上述细胞作业是ENTPD-目标shRNA表达所特异引起的，作者进一步在这些细胞中引进了一个编码ENTPD5的cDNA， withshRNA靶向序列的沉默变异。在这些细胞中，内源性的ENTPD5仍然被敲除by加入DOX，一个shRNA抵抗的野生型转基因的表达，led to“ BiP的表达，下降了糖基化？，下调的生成因子受体”这些现象，一个完全的逆转！！相反，引入E171A突变体（废除ENTPD5的UDP水解活性）没有能够挽救这些现象。甚至，另一个ER压力标志：CHOP也被诱发。
在生成因子受体由于ENTPD5敲除后丢失的同时，细胞的生长同样非常明显地受抑。

7、ENTPD5促进有氧酵解
ENTP5表达升高的一个重要的意义是ATP的明显消耗，这这个the ENTPD5/CMPK1/AK1 enzyme cascade中，于是，需要更多的ATP，由于在两个细胞群的比较中发现，pten null EMF的培养基中可以测出更多的乳酸，confirm了需氧酵解的升高。这个乳酸的升高与ENTPD5的过度表达相关。以6中方式进行了进一步验证。