TNFR信号通路系列之二：RIP家族

TNFR信号通路系列之二：RIP家族

一、RIP家族

1995年，Stanger BZ通过酵母双杂交首次发现了一个与Fas相互作用的蛋白，因而命名为受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP），随着RIP家族成员的增多，它被称为RIP1[1]。

RIP 家族成员均有一个同源的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，具有激酶和非激酶的作用，因此具有激酶作用的 RIP 又被称为受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK)。目前临床上发现RIP家族共7个成员，分别为RIP1~7[2,3]。

RIP1~7的N末端结构具有高度同源性，激酶结构域具有相似性，提示RIP1~7蛋白家族成员可能具有某种相同或者相似的生物学功能。而RIP1~7家族的中间结构、C端结构之间存在一定的差异[2]。

• RIP1：DD-RHIM-ID。RIP1 的C端结构含有一个死亡结构域 （death domain，DD），但是中间结构则包含一个RIP同型结构域 （a RIP homotypic interaction motif，RHIM）和一个与相互连接的中间域（a bridging intermediate domain，ID）；
• RIP2：CARD-ID。RIP2 的C端结构则含有一个caspase募集域（caspase recruitment domain，CARD），但是其中间结构仅包含有一个ID；
• RIP3：RHIM。RIP3比较特别，其C端结构是RHIM，且缺少中间结构域；
• RIP4 和 RIP5：AD-ID。RIP4 和 RIP5 的C端结构都是锚蛋白域（ankyrin domains，AD），但是其中间结构则是ID；
• RIP6 和 RIP7 的结构与其它 RIP 家族成员相关性较弱。除了包含 RIP 家族共有的激酶结构域和锚蛋白重复序列，还包含一些其他结构域，如富含亮氨酸重复序列和 WD40 重复序列[3]。

1、RIP1的结构和功能[2]

（1）RIP1 中间域（ID）的 Lys377 是泛素分子 Lys63 介导的一个重要的泛素化 RIP1 位点。RIP1位点发生泛素化后，Lys377可以与其他泛素受体蛋白相结合并形成复合体，此时 RIP1 能够与 NF-κB 结合发生转录，并通过这种方式调节人体细胞的生存状态。

（2）RIP1上的RHIM，可与其他含有RHIM蛋白或相关因子的家族成员（如RIP3、IFN-β、TRIF、DAI[3]）进行相互作用。RIP1 能够与 RIP3 中的 RHIM 相互作用，并形成一个丝状淀粉样结构，且这一结构对调节人体中的坏死性凋亡（necroptosis）机制具有决定性作用。

（3）RIP1 死亡结构域（DD）是 6 螺旋折叠的结构状态，而这种 6 螺旋折叠结构在 TRADD（TNFR1 associated death domain protein，TNFR1相关死亡结构域蛋白）和 FADD（Fas-associated death domain protein，Fas相关死亡结构域蛋白）中同样存在。

2、RIP1的调节

RIPK1 的两个重要方面是 RIPK1 的泛素化状态和激酶活性[11]。

• RIPK1 的多泛素化状态决定了其发挥抗凋亡（复合体Ⅰ中的泛素化RIP1）或促凋亡（复合体Ⅱb中的去泛素化RIP1）作用。
• RIPK1 的激酶活性对其促进 caspase-8 激活复合物形成和随后的细胞凋亡的能力至关重要（复合体Ⅱb），但对于 NF-kB 激活是可有可无的（复合体Ⅰ）。

（1）RIP1的泛素化[1-3]

• 在 TNF-α 诱导下，RIP1 的 Lys377 是其功能性的唯一结合泛素化位点，在激活 NF-κB 活性中是必需的；
• RIP1 的 Lys63 位点的泛素化促进了其下游 NF-κB 的激活；
• 但是，RIP1 的 Lys48 位点可被锌脂蛋白 A20 泛素化引起 RIP1 的降解，抑制 RIP1 诱导的 NF-κB 的激活。

（2）RIP1的去泛素化

RIP1 的 Lys63 位点被 TRAF2 泛素化后，RIP1 就可以结合到 TNFR1 复合物上。随后，锌脂蛋白 A20 通过其 N 端的去泛素化结构域移去 RIP1 的 Lys63 位点上连接的泛素链，A20 的 C 端泛素连接酶在 RIP1 的 Lys48 连接上蛋白水解酶所识别的泛素链，使 RIP1 最终被降解[1]。

（3）RIP1/RIP3

RIP3 含有与 RIP1 相似的 N 端激酶结构域和 C 端 RHIM 基序。RHIM 可与具有相同结构的蛋白（RIP1、TRIF、IFN、DAI）相互作用。

RIP3 与 RIP1 结合，RIP3 可磷酸化 RIP1，但 RIP1 不能磷酸化 RIP3。磷酸化的 RIP1 抑制 NF-κB 的激活[1,3]。

（4）热休克蛋白90（Hsp90）

Hsp90 在维持 RIP1 的稳定性和可溶性方面发挥着重要作用[1]。Hsp90 能够促进 RIP1 的调控，其功能受到抑制会影响 RIP1 功能的发挥及其应对TNF刺激时下游信号的转导[3]。

二、TNFR1复合体Ⅰ（NF-κB信号通路）

TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、cIAP1/2共同形成TNFR1复合体Ⅰ。复合体Ⅰ装配完成后，RIP1被快速多聚泛素化，该过程对于 IKK 复合物的募集和NF-κB的活化都是必要的。TNFR1复合体Ⅰ的形成过程见帖子：TNFR1相关复合体。

（1）RIP1泛素化

TRAF2、cIAPs 可作为 E3 泛素连接酶[9]，与LUBAC（liner ubiquitin chain assembly complex，线性泛素链组装复合体）[2,3,7,9]一起在 RIP1 上形成 K63 或 K11 多聚泛素链[3,9,11]。RIP1 的泛素化对于 NF-κB 的激活是必要的。

（2）NF-κB信号通路的激活

多泛素化的 RIP1 能够与 TAK1（TGF-β-activated kinase 1，TGF-β激活激酶1） 信号通路、TAB2/3 （TAK1-binding proteins）信号通路相结合[3,9]。结合后 TAK1 信号通路和 TAB2/3 信号通路能够磷酸化 MEKK3（MEKK3见帖：MAPK信号通路） [3]。MEKK3 使 PIR1连接到 IKK 上。RIP1 通过 ID 结合 IKK 的调节亚基 NEMO，从而激活 IKK，进而激活 NF-κB信号通路[1-3,5,6,9,10]。NF-κB信号通路见帖：NF-κB信号通路。

NF-κB信号可诱导抑制凋亡蛋白基因转录而负向调节凋亡，包括 cIAP1/2、c-FLIP、Bcl-2 家族[3,10,11]。

（3）JNK信号通路的激活

TRAF2 和 RIP 还可以直接或间接地活化 MEKK1（MEKK1见帖：MAPK信号通路），MEKK1 可激活 JNK 信号通路，使细胞色素（Cyt-c）释放（即通过线粒体介导通路导致细胞凋亡）[8]。

三、胞质复合体Ⅱ中的RIP1（细胞凋亡）

Smac 使 cIAP1/2 自降解，随后 TNFR1复合体Ⅰ从质膜上解离，转移至胞质内。RIP1从复合体Ⅰ中释放，剩余适配蛋白形成了胞质复合体Ⅱa，而被释放的RIP1去泛素化形成了胞质复合体Ⅱb。胞质复合体Ⅱa 或 Ⅱb 的形成见帖子：TNFR1相关复合体。

（1）Caspase级联反应

胞质复合体Ⅱa 和 Ⅱb 均含有 FADD 和 Pro-caspase-8。Pro-caspase-8 是由 FADD 通过 DED 相互作用募集而来（DED位于 Caspase 的 prodomain 结构域）。胞质复合体Ⅱa 和 Ⅱb 通过 Caspase-8 发出细胞凋亡信号，激活下游的 Caspase-3 和 Caspase-7，启动外源性凋亡[3]。Caspase级联反应见帖：Caspase级联反应。

（2）RIP1片段

RIP1在 天冬氨酸324 被 Caspase-8 剪切，产生2个片段。其中 C 端片段包含完整的 DD 和大部分 ID，可增强 TNFR1 与 TRADD、FADD 的结合，进一步活化 Caspase-8，诱导细胞凋亡，且诱导凋亡能力强于全长的RIP1[1,9]。

四、坏死复合体（坏死性凋亡，又称程序性坏死）

通过RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路引起坏死性凋亡。

1、RIPK1/RIPK3

（1）RIPK1招募RIPK3

胞质复合体Ⅱb 形成过程中，RIP1 去泛素化后，若 caspase-8 或 FADD 缺失，RIP1 与 RIP3 中的 RHIM 相互作用，形成坏死复合体[3]。RIP1和RIP3在诱导坏死性凋亡过程中发挥其激酶作用，因此又被称为 RIPK1 和 RIPK3。坏死复合体的形成见帖子：TNFR1相关复合体。

（2）RIPK3磷酸化

RIPK3 激酶结构域可发生自身磷酸化。磷酸化的 RIPK3 激活 MLKL[3]。

• RIPK1 和 RIPK3 的激酶结构域均可发生自身磷酸化[1,10]。RIPK3 与 RIPK1 结合，RIPK3 可磷酸化 RIPK1，但 RIPK1 不能磷酸化 RIPK3。磷酸化的 RIPK1 抑制 NF-κB 的激活[1]。
• RIPK3 去磷酸化可抑制细胞坏死性凋亡的发生[3]。

2、MLKL

（1）MLKL结构

MLKL （mixed lineage kinase domain like protein，混合谱系激酶结构域样蛋白）由一个 N 端卷曲螺旋结构域和一个 C 端假激酶结构域组成，空间构象为一个与假激酶结构域相连的四螺旋束[9]。

•  N 端螺旋束对于 MLKL 的寡聚化很重要
•  C 端为典型的激酶样折叠。但与经典激酶不同，MLKL 在催化环的HRD基序中缺乏典型的Asp，在 DFG基序中缺乏负责Mg2+协调，被称为假激酶结构域。因此 MLKL 尽管能够结合 ATP，但 MLKL 没有催化活性。

（2）MLKL磷酸化

MLKL 是 RIP3 的下游靶标，激活的 RIP3 招募 MLKL 并将其磷酸化（人MLKL激酶样结构域的 Thr357/Ser358 位点，小鼠 MLKL 的 Ser345/347/352 和 Thr349 位点）。RIP3 介导的 MLKL 磷酸化触发其构象变化，导致 MLKL 的 N 端四螺旋束暴露，进而导致 MLKL 三聚化，形成磷酸化的三聚体[3,9,10]。未被激活的 MLKL 以单体形式存在于胞质中[10]。

（3）成孔复合体

MLKL 三聚体可以结合磷脂酰肌醇磷脂（phosphatidylinositol phosphate lipids，PIPs）和线粒体特异性的心磷脂（cardiolipin，CL），使 MLKL 与膜结合并将其 N 端插入各种细胞器和质膜。MLKL 三聚体作为成孔复合体，直接导致细胞坏死性膜破裂[3,9,10]。

3、坏死性凋亡特点[12]

尽管程序性坏死（Necroptosis）与细胞凋亡存在共同的上游分子，但是两者结果不同，程序性坏死对组织稳态的破坏性更大。

• 细胞凋亡通过线粒体凋亡途径，而坏死性凋亡可以独立于线粒体进行[9]。
• 与细胞凋亡相比，程序性坏死不引发核固缩，染色质不会凝聚，不伴有线粒体细胞色素 C 释放，不产生核小体 DNA 片段。程序性坏死主要特征是线粒体功能障碍，线粒体膜电位缺失，细胞器及细胞肿胀破裂，膜完整性被破坏，细胞内含物漏出。

部分细胞内含物将作为DAMPs进入周围组织，引发周围组织的反应 （如炎症反应等）。

• DAMPs （damage associated molecular patterns，损伤相关分子模式）指机体自身细胞死亡所释放的内源性危险分子。目前研究最多的 DAMPs 包括高迁移率组蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1），热休克蛋白 （HSP），IL-1 等， 这些分子可以对周围组织造成进一步破坏效应。

此外，细胞内容物还可以导致自噬溶酶体活化，部分坏死细胞的活性氧（ROS）浓度增加。

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参考文献

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[12]杨祖阁,王若欣,任昊喆,何峰,马原军,于世宾.程序性坏死在骨骼相关疾病中的研究进展[J].中国骨伤,2021,34(07):687-690.