【求助】用cDNA序列引物扩增基因组序列的困惑。
我从我的植物的cDNA中用RACE PCR 的方法找到了一个基因的全长,然后用得到的序列设计两端的引物扩增除了该基因的cDNA全长。现在我想用这对引物以基因组DNA为模板扩增出该基因在基因组内的序列,但是重复了几次后都一个带都没有,每次我用的都是试剂盒里面带的水,premix,基因组DNA是用CTAB 的方法提取的,之后用DW+RNase来溶解,在PCR体系中分别用原浓度和稀释了10倍, 30倍,50倍的稀释液作为模板。而之前我用这对引物在这个PCR条件下,以该基因转基因拟南芥的基因组DNA为模板的时候扩增到了目的片段。
我想问的是:既然这对引物在这个条件下可以从cDNA和拟南芥基因组DNA中扩增出目的条带,那就说明这个PCR反应体系是没有什么问题的,因为基因组中的序列长度比cDNA长约1Kb,所以我把延伸时间从两分钟延长到了2分半,那样的话也应该够用了吧?该植物的基因组DNA我也跑了电泳,质量不错,那为什么把原植物的基因组DNA稀释不同倍后作为模板就扩增不出条带来呢!?用该基因ORF两端的引物来扩增,即使是基因组DNA也应该是有条带的啊,可为什么就是没有呢?原因是因为我这个基因在原植物基因组中的丰度太低吗?如果是这样的话,该如何解决呢?增加引物浓度?增加底物浓度?
最后编辑于 2008-12-02 · 浏览 7129