引物修饰|引物不只是引导DNA合成那么简单

我以前的帖子中提到EMSA和探针法qPCR都使用了引物修饰。EMSA实验的oligo修饰是为了进行示踪，后期进行印记实验；而探针法qPCR的探针修饰，是为了量化检测荧光信号，进行定量检测。随着荧光化合物的不断涌现，化学合成技术的不断发展进步，引物修饰逐渐多样化，使引物发挥了更多的功能作用，而不再只是引导DNA合成那么简单。

引物修饰通常分为四类。

1.间臂修饰：

• Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔， 或“替代”一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。可以修饰在 5'端、3' 端以及中间，并且中间可以修饰多个， 当修饰在引物 3' 端时，能够起到阻止 DNA 聚合酶延伸的封闭作用。PC（Photo-Cleavable） spacer/linker 可放置在 DNA 碱基之间。它可以在 300-350 纳米光谱范围内的紫外线照射下被劈裂，释放具有 5'- 磷酸基的 Oligo。Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。

2.化学连接类修饰：

• 氨基修饰（Amino）：伯氨基可用于将多种修饰剂 （例如荧光染料） 连接至寡核苷酸或用于将寡核苷酸连接至固体表面。在使用过程中不反应。氨基修饰广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统。目前提供C6 氨基修饰和C12氨基修饰两种， C6、C12 等代表了 NH2 与 DNA 之间的直链亚甲基长度，起到增加空间距离的作用。前者可用于连接一些即使靠近寡 核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些不能太靠近 DNA 链的基团（如容易被 DNA 淬灭的荧光基团）的连接。
• 生物素（Biotin）：卵白素-生物素（avidin-biotin）技术应用广泛，包括用于非放射性免疫分析来检测蛋白质，胞内化学染色，细胞分离，核酸分离，杂交检测特异性的DNA/RNA序列，离子通道构象变化的探针等。功能化的生物素还可用在已包被的固相表面的的固定。最近也在探讨将这项技术用于光降解的生物素产品。所有这些应用需要包含有一个或多个的生物素标记的的特异性寡核苷酸。
• 地高辛（Digoxin）：地高新是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质，因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源，所以抗地高新抗体不会结合到其他生物物质。地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，可与氨基修饰的寡核苷酸偶联的小半抗原。抗地高辛抗体允许捕获或检测 Dig 标记的寡核苷酸。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应，如 DNA-DNA 杂交（Southern blotting）、DNA-RNA 杂交（Northern blotting）、斑点 杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。
• 巯基（Thiol）：5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite or the Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。

3.碱基修饰：

• 2-氨基嘌呤：2-氨基嘌呤是最常用的核苷类似物，可以替代寡核苷酸中的 dA。它是一种对局部环境敏感的天然荧光基团，能够监测DNA 发夹的结构和动力学。2-氨基嘌呤可能会稍微降低 Tm 值。
• 脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine dI）：脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的通用碱基，与 ATCG 都能配对，当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。然而其并不是真正意义上的通用碱基，脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为 dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT。在 DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与 dC 结合。
• 脱氧尿嘧啶（deoxyUridine dU）：在 DNA 寡核苷酸中可取代 dT。尿嘧啶 -DNA 糖基化酶（UNG）可以去除该碱基，使 Oligo 断链。这种策略的一个常见用途是消除前一轮扩增的 DNA 并防止交叉污染。另外，脱氧尿嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的 Tm 值从而提高双链的稳定性，但这种 Tm 值的增加效果有限。
• 5-溴脱氧尿嘧啶（5-Bromo dU）：5-溴脱氧尿嘧啶是一种光反应卤化碱基，5-BrdU 是一种核苷类似物，可与胸苷竞争掺入 DNA。 5-BrdU 通常用于检测增殖细胞。
• 双脱氧胞嘧啶核苷（DiDeoxyCytidine ddC）：ddC 为双脱氧胞嘧啶核苷，修饰在 Oligo 最后一个碱基，能够防止 Oligo 链的延伸。
• 锁核酸（LNA）：LNA 碱基对核糖的主链进行修饰，将碱基锁定在 C3- 内侧位置，有利于 RNA A 型螺旋双链结构。这种修饰能显著增加Tm 值，并且对核酸酶有很强的抵抗力。

磷酸化修饰（Phosphorylation）/硫代修饰（Phosphorothioate）：

• 磷酸化修饰：5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应，作为 DNA 连接酶的底物。3'磷酸化可抗 3'外切 酶消化，也用于阻止 DNA 聚合酶催化的 DNA 链延伸反应。
• 硫代修饰：硫代修饰（PS）用硫原子代替 Oligo 磷酸骨架中的非桥氧原子。这种修饰使得核苷酸间的连接抗核酸酶降解。