求助： 肝组织蛋白提取

本人在进行肝组织（包括肝癌组织）的蛋白提取，因为需要的是磷酸化的蛋白，所以需要格外的小心，以下为我所用的蛋白提取步骤：

组织蛋白提取：
1.称取－80度保存组织100mg于铝箔中，放入液氮内1~2h，待组织变硬后碾
碎；再放入液氮中10分钟左右，反复3次，至组织成为粉末状；将粉末
倒入灭菌EP管中；
2 往EP管中加入400ul裂解液（含PI），充分混合；置于冰上，超声裂解，3×
10次；4度离心，13000rpm，15分钟；
3. 取上清于灭菌EP管中，弃沉淀和脂肪组织；
4. 蛋白浓度测定

说的很容易，但是做起来就感觉不是很顺手：
1>蛋白从－80度冰箱中取出，然后放入铝箔中用锤子砸，结果老是把蛋白弄的到处都是；
2>蛋白没有象想像的那样变得跟粉末一样，而是肉饼一样，放入裂解液中反复进行吹打，还是太多无法溶解的物质，虽然包括了纤维结缔组织，但是，量剩余太多；

问题：
1>看到好多类似帖子说组织在液氮中碾磨，如何操作？
2>用超声裂解的过程中是否会导致过多的蛋白降解？
3>作GST－pulldown用的蛋白浓度设置在多少为好？

谢谢^_^