从蛋白提取到western blot操作

我们常说的WB---蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

影响WB结果的因素众多，从样品制备、做胶跑胶、一抗二抗孵育到显影任何一个步骤出错都可能导致结果误差，甚至显影没有条带。

样品制备

贴壁细胞总蛋白提取

1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。平皿的话，直接将培养基吸干。

2. 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞两次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（10CM皿用2ml 4℃预冷的PBS洗2次）

3. 按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4. 每瓶细胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（10CM皿用200ul含PMSF的裂解液）

5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮到培养瓶或平皿的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6. 将蛋白放入95℃以上的水浴或者金属浴中使蛋白变性10min（如果你跑WB为了证明蛋白浓度趋势，这一部必不可少）

7. 超声破碎10s(可选步骤)

8. 于4 ℃下12000rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）

9. 将离心后的上清分装转移到新的离心管中放于－80 ℃长期保存或-20℃短期保存。

（某些实验室是将上样缓冲液跟裂解液一起加入裂解细胞的，几乎结果一致，但缓冲液提前加容易气泡）

组织样本的总蛋白提取

1. 将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。20 mg组织加入100 ul裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次。(如使用组织匀浆机，则按照20 mg组织加入100 ul裂解液的比例加入裂解液。每个试管加入2个直径2 mm的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60 HZ，300s。充分裂解后，10000 g离心5 min，取上清。)

2. 最大速度涡旋震荡10 sec，冰上放置20 min，期间取出震荡3-5次,再于4℃， 12000 rpm 离心10 min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。

制备完样品可以进行Bradford 法、BCA 法、 Lowry 法或考马斯亮蓝-G250进行蛋白浓度测定。

BCA蛋白浓度测定

1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

2. 完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100 ul，使终浓度为0.5 mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释标准品。

3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ul加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20 ul。

4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液至20 ul。

5. 各孔加入200 ul BCA工作液，37℃放置30分钟。注: 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显影反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。

测定562 nm波长处吸光值，540-595 nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

制胶

胶的制备是实验的关键，分子量越大，胶的浓度越底。分子量在20-250 Kda的蛋白可以用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。（注意这里的浓度是聚丙烯酰胺的浓度,并且是分离胶的浓度，浓缩胶可以通用5%聚丙烯酰胺浓度）

体积不变的话，只计算改变红框部分，若体积变化，按每一组分的浓度进行计算，如SDS的最终浓度为0.1%。

1. 根据蛋白的分子量确定好SDS-PAGE胶的浓度，装配好灌胶的模具。

2. 进行分离胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10% SDS，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（注：不要产生气泡），将此液体缓慢加入到模具内。

3. 加入分离胶后轻轻在分离胶溶液上覆盖上水。

4. 等待10-20min，待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。

5. 进行浓缩胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10% SDS，浓缩胶缓冲液，混匀。按照配方加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（注：不要产生气泡），将此液体缓慢加入到分离胶的上面，直至灌满，将梳子插入凝胶内（保证梳子齿末端没有气泡）。

6. 等待30 min左右，待凝胶聚合后小心拔出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。

目前很多公司都有非常多的预制胶，可以购买预制胶进行配制，更加简单。

上样与电泳

 1. 将电泳缓冲液加入内槽中，使凝胶的上端能浸泡在电泳缓冲中，电泳液几乎平齐长板。我有一个习惯，就是将内槽取出放在桌面上，往内槽加满电泳液，用200ul的枪吹孔，然后上样。（步骤2有解释，检漏用的）

2. 将制备好的样品与上样缓冲液按比例混合，95 ℃-100 ℃加热3-5 min（提取蛋白时煮过就不用再加热了），取15 ul(可根据试验情况进行调整)将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照，如果有条件可以两边加入不同颜色标记的marker作为样品顺序标记，就不用在膜上进行标记了。上完样将内槽放入电泳槽中，此时如果刚刚放内槽的桌面没有留下电泳液，表明没有漏液，往外槽加电泳液至点一条水位线即可，如果漏液，要么更换或者重装内槽，要么，外槽加满电泳液。

3. 接通电源进行电泳，开始时使用低电压80V进行电泳，待溴酚蓝跑过浓缩胶后，加大电压至120V。观察marker，待maker显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离停止电泳，一般情况下是等溴酚蓝标记的样本跑到最底部，目标蛋白的分子量不同电泳停止的时间不同，视实验而定。

很多同学问我，为什么自己跑电泳要外槽要加满电泳液，否则条带会歪。这里给大家精心制作了一个蛋白电泳电路导图，供大家理解。

转膜

转膜是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。转膜的方法可分为半干转和湿转。可以选择PVDF膜和NC膜。PVDF膜与目的蛋白结合能力较高，灵敏度高，不易破碎，可适用于再次标记（使用前需要浸泡在甲醇中激活）。NC膜不需要甲醇激活但易破碎。膜的规格有0.45 μm和0.2 μm两个规格，大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白要用0.2 μm的膜。

1. 根据胶的大小剪PVDF膜（使用前需要用甲醇处理）和滤纸，放到转膜缓冲液中平衡10 min左右（非两种彩色mark，剪角作为标志方向）。

2. 装配转膜，在海绵上放置1层已经用转膜液浸泡过的滤纸，将胶拆下来，小心翼翼地将其转移到滤纸上方，放置处理好的PVDF膜，再放置另1层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置另一块海绵，注意每层之间都不能有气泡，用转膜仪中的支架夹住。（胶位于负极，转膜方向从负极到正极）

3. 将转膜“三明治”放置到转膜槽中，加转膜缓冲液，将转移槽置于冰浴中。插上电极，根据蛋白分子量确认转膜的电压、电流、时间，我这边普通电泳液通常采用300mA 100分钟，快速转膜液400mA 30min(常温电泳)。

4. 转膜结束后，切断电源，取出PVDF膜。

封闭及免疫杂交

为了防止抗体和膜非特异性的结合，要将除目的蛋白外其他无结合蛋白位置封闭起来，防止后面一抗非特异性结合产生较深背景。常用封闭物有脱脂奶粉和 BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。

封闭后，目标蛋白便与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测（直接法），降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法），对信号有级联放大作用，可以增加灵敏性和信噪比。二抗既可标记放射性同位素，也可标记染料或其他分子，或与酶偶联。常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号。

用适量的TBS/PBS洗已经转好的膜，室温，放到摇床上晃动。

1. 将膜置于约25 ml封闭缓冲液中1 h，室温，置于摇床上晃动。

2. 15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5 min）。

3. 加入稀释过的一抗，室温孵育1-2 h或4 ℃过夜，缓慢晃动。

4. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5 min）。

5. 加入稀释过的二抗，室温孵育1 h，缓慢晃动

6. 用15 ml TBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约 5min）。（注:最后一次要用不含Tween的溶液清洗）   

注：实验的条件可根据实验情况进行调整。

显影

显影的方法包括化学发光法以及生色底物显影法进行实验，并通过胶片或影像系统（CCD）收集。因为二抗上标记分为有HRP（辣根过氧化物酶）以及AP（碱性磷酸酶），两种二抗可供选择的方法也不同。

标记HRP（辣根过氧化物酶）的二抗：

化学发光底物：一般使用ECL发光法进行实验，ECL中含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

生色底物：HRP的生色底物显影有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等。

标记AP（碱性磷酸酶）的二抗：

AP的生色底物：BCIP，NBT和INT

虽然自己整理过这些方法，但写到这里还是有点累，大家有什么问题可以私信也可以留言，关于WB实验的其它细节，以后再写吧。

最后附上自己最近发的文章跑的WB，祝愿大家都能跑出好看的data！