构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程

1 背景知识介绍

1.1 什么是基因突变

基因突变（Genetic mutations）：遗传物质在复制或细胞分裂过程中可能发生的DNA或RNA核苷酸、基因或染色体的轻微改变。随机的、未修复的突变对进化可能是有益的，也可能是有害的。

1.2 基因点突变类型

核苷酸数量或类型的变化称为点突变，点突变的影响范围从无害到威胁生命。当核苷酸碱基错配或重排序的变化不影响细胞功能时，被认为是沉默突变。新的氨基酸甚至可以发挥与它所取代的氨基酸相同的功能。现目前，点突变是很多前沿研究的热点，例如大规模测序，找到易感基因，然后根据易感基因再找到易感位点；蛋白的修饰，比如磷酸化、棕榈酰化、瓜氨酸化等等；这些数据的获得或者后续的验证，都是常规实验很难达到的。那么基因的点突变主要包含一下几种类型：

（1）错义突变（Missense mutation）：当编码区一个核苷酸被另一个取代时就会发生这种情况，导致致多肽产物的氨基酸序列改变，这种碱基的取代会干扰正常的蛋白质合成和功能。

（图1 错义突变示意图，即核苷酸的突变导致编码氨基酸改变）

（2）无义突变（Nonsense mutations）：编码区核苷酸的突变，产生了一个过早的终止密码子或者一个不编码任何氨基酸的密码子，这种突变会影响蛋白质的正常功能。

（图2 无义突变示意图，即核苷酸的突变终止信号提前）

（3）移码突变（Frameshift mutations）：再编码区的突变过程中，插入或删除的核苷酸数量不是三的倍数（三个碱基是一个密码子），改变了突变下游基因部分的读取框架，导致其编码完全不同的蛋白质序列。

（图3 移码突变示意图）

（4）同义突变（synonymous mutation）：指编码区片段中某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸，其原因在于该位置的密码子突变前后为简并密码子。

（图4 同义突变示意图，即虽然核苷酸改变，但不改变编码的氨基酸）

突变的其它类型：拷贝数变异（Copy Number Variation Mutations）、染色体突变（Chromosomal Mutations）等，这些是一种更复杂、更大范围的突变，往往与疾病相关，但是从进化的角度来说，是好是坏，还需要时间上的考量，在这里就不再赘述。

2 野生型TNF-α真核表达载体构建

2.1 野生型TNF-α序列下载

（1）首先在NCBI下载人类TNF-αmRNA序列

查询并定位基因：直接进去NCBI，数据库选择“Gene”，复选框输入“TNF-α human”，点击search即可获得数据库中收集的相关数据，如图1和2（选择人类的TNF-α基因即可）所示：

（图5 检索人类人类TNF-α基因）

（图6 检索到人类TNF-α基因，点击进入获得基因及氨基酸序列）

 （2）定位CDS区：基于上一步的操作，定位到具体的mRNA信息（NM_000594），并在同一页面找到该基因的CDS区，点击CDS即可获得CDS区的碱基序列；

（图7 定位并获取CDS的碱基序列）

 （3）下载mRNA碱基序列：通过点击图4的CDS，即可转到基因的编码区序列信息展示界面，其中整个编码区从ATG（起始密码子）-终止密码子（TAG），均别着色；将整个mRNA序列下载保存，将获得编码区序列保持到DNAstar的EditSeq软件中（如果已经下载了，直接将序列保持到txt文件中，并将后缀改为“.seq”即可）；

（图8 有背景的碱基即为整个编码区的序列）

2.2 扩增整个mRNA序列引物设计

2.2.1 引物设计一般规则

一般情况下，一对有效的引物需要满足或接近一下条件，才能够有效的实现靶基因的扩增：（1）长度为18-24个碱基；（2）G/C含量40-60%；（3）以1-2对G/C开始和结束；（4）退火温度(Tm) 50-60℃；（5）引物对之间的Tm相差应在5°C以内；（6）引物对不应有互补区域；

2.2.2 确定使用过表达载体上的酶切位点

本次使用pEGFP-N1真核表达载体，构建点突变基因的重组表达质粒，上游引物酶切位点F: Hind Ⅲ;下游酶切位点R: Kpn Ⅰ。

(图9 pEGFP-N1载体，本次选择F: Hind Ⅲ;R: Kpn Ⅰ)

2.2.3 mRNA的起始密码子/终止密码子定位

设计的引物目的是为了扩增一条功能完整的mRNA（即完整的CDS区） ，因此，我们设计的上游引物必须包含起始密码子，下游引物必须包含终止密码子。因此，我们在设计引物之前我们需要确定TNF-α的mRNA中CDS区的ATG和TGA所在位置。这里我们使用使用DNAstar软件的MegAlin执行Align-By Clustal W method，进行序列比对，定位ATG（179）和TGA（879）。

（图10 TNF-α起始密码子定位）

（图11 TNF-α终止密码子定位）

 2.2.4 软件oligo 7引物设计

（1）执行file- New sequence，并将mRNA序列粘贴到oligo 7软件输入框，点击上边“√”即可；

（2）上游引物设计，首先然引物起始位点始于ATG的A，并点击正上方的Forward primer定义为上游引物（F）；

（图12 上游引物起始点）

（3）通过往135/134以前移动和改变引物长度（执行“change- current oligo length”），进行引物设计（引物起始始于120，长度为22bp，Tm=55.4）；在此基础之上分析：1，二聚体：执行“analyze-duplex formation- forward”，在结果中保证|△G|≤3；2，发卡结构：执行“analyze- hairpin formation- forward”，在结果中最好没有发卡结构，如果有必须让打开发卡结构的Tm值≤20；3，引物错配分析：执行“analyze- false priming sites- forward”，第一列的 priming efficiency没有数值最好，如果有越高越好，从第二列开始priming efficiency数值低于100，最多不超过150.

（图13 上游引物二聚体结构分析，3’未发现二聚体结构，结果良好可用）

（图14 上游引物发卡结构分析，3’未发现发卡结构，结果良好可用）

（图15 上游引物错配分析，结果良好可用)

同理：设计下游引物，值得注意的两点：1，下游引物3’端末端为TAG的G；2，如果1不满足要求，下游引物的延伸需要向3’往后延伸，这与上游5’端往前的方向是相反的。

（4） 保存引物，执行“file- save- forward primer”，并进行相应的命名，然后将引物序列的5’端加上Hind Ⅲ碱基序列（AAGCTT）;下游5’端加上Kpn Ⅰ（GGTACC）；

F1: AAGCTT TCTCTTCCTCTCACATACTGAC

R2: GGTACC GGGAAGGTTGGATGTTCGTC

（备注：我们通过以上操作几乎就能扩增到野生型的TNF-α基因序列，在此，还不需要构建真核过表达重组质粒，我们可以以此为模版构建突变TNF-α序列）

3 突变序列的构建

3.1 野生型氨基酸的信息确定

对于野生型核苷酸与氨基酸的翻译，我们使用DNAman软件进行，如图16所示，DNAman的工作界面展示。

（图16 DNAman软件打开示意图）

碱基密码子翻译成氨基酸：点击图17中红色箭头指示的碱基翻译成氨基酸序列的功能按钮，即可完成密码子-氨基酸的改变（前提是要选中所有的碱基序列）；

（图17 将核苷酸翻译为氨基酸操作）

（图18 碱基及氨基酸展示结果选中，我喜欢图中的这种设置，大家也可以自己喜欢的展示形式选择对应的展示选框）

（图19 碱基-氨基酸对应模式，红框标记的碱基和氨基酸是本次需要突变的位置）

3.2 TNF-α 第100号氨基酸G突变为氨基酸R

突变氨基酸及碱基确定：本次突变的信息是将第100号氨基酸-G（甘氨酸GGG）突变为氨基酸-R（精氨酸CGG），那么我们只需要将298的碱基“G”突变为“C”即可（如图19所示）;各位看官可以根据自己的实验进行相应的突变。 

(图20 氨基酸中英文，三字母，单字母表示方法)

（图21 氨基酸及对应密码子）

将原始数据中第298为碱基G改为C，氨基酸英文，三字母，单字母表示参考图20，氨基酸和密码子的对应关系参考图21：

3.3 突变信息的确定

突变氨基酸及碱基确定：本次突变的信息是将第100号氨基酸-G（甘氨酸GGG）突变为氨基酸-R（精氨酸CGG），那么我们只需要将298的碱基“G”突变为“C”即可;各位看官可以根据自己的实验进行相应的突变。

将原始数据（即CDS区）中第298为碱基G改为C，参考图22：

(图22 TNF-α CDS区原始碱基的G改为C示意图)

 3.4 突变引物的设计

尽可能的将突变的碱基包含在引物的中间，至于针对包含突变的引物上下游要求不高，原因有二：1，我们已经用特异性TNF-α引物扩增到TNF-α基因序列；2，突变区的上下游引物将会与前边设计的F1/R1进行匹配扩增，TNF-α的片段，因此，可以在同一位置设计F2/R2,当然也可以在不同位置，但必须包含突变碱基去设计引物，本推文就在同一位置设计F2/R2。

（图23 将突变的碱基至于引物的中间位置较好）

 3.5 正确使用F1/R1和F2/R2扩增获得突变TNF-α序列

对于突变引物的设计，我们需要两对引物实现基因的点突变，第一对引物（F1/R1）用于扩增囊括整个CDS区，第二对引物（F2/R2）（该对引物不要遵循严格的引物设计规则，只需要保证突变的碱基被包括进去，长度大概在18-30bp之内）在点突变的位置进行设计，需要尽可能将突变点至于引物中间。PCR扩增过程中分为四步：第一步：F1-R1扩增获得TNF-α基因；第二步F1-R2;第三部F2-R1；第四步，将第二三步的PCR产物作为模板使用F1-R1扩增获得整个突变后的序列（参考图24）。

（图24 双引物PCR扩增突变基因序列示意图）

 4构建突变重组真核表达质粒

4.1 pEGFP-N1酶切

Table 1 pEGFP-N1酶切酶切及反应体系

4.2 连接反应

Table 2 TNF-α扩增产物与pEGFP-N1酶切产物连接体系及反应

4.3 重组质粒转化DH5α

（1）使用10μL的连接产物转移至DH5α感受态细胞中（冰浴25-30分钟，42℃热激45-90秒，冰浴5分钟）；

（2）使用600μL的 Ampicillin-free 的LB在37℃复苏1-2小时；

（3）离心菌液，留存100μL的 LB重悬菌体沉淀，后涂布至含有ampicillin的 LA板中；

4.4 重组质粒阳性克隆的验证

（1）挑选3-5个LA板的单克隆菌落，利用10μL LB（Ampicillin）重悬菌落，然后利用1-2μL菌液进行PCR验证，经过电泳检测是否含有目的条带。

（2）挑选3-5个LA板的单克隆菌落，利用600μL LB（Ampicillin）培养菌落不低于6小时后提取DNA，利用AgeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，看是否包含有目的条带。

（3）将第二步获得的菌液或者是DNA送测序，测序结果是否包含咱们的目的shRNS序列。

（4）去内毒素/小提中量提取目的质粒

将阳性克隆利用25-35ml LB（ampicillin）培养过夜（12-16小时后），然后利用去内毒素/小提中量试剂盒提取目的质粒。

（5）成果获得突变TNF-α质粒用于后续实验。

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