如何构建基因点突变序列从理论到实践-手把手教学

1 背景知识介绍

1.1 什么是基因突变

基因突变（Genetic mutations）：遗传物质在复制或细胞分裂过程中可能发生的DNA或RNA核苷酸、基因或染色体的轻微改变。随机的、未修复的突变对进化可能是有益的，也可能是有害的。

1.2 基因突变和突变功能的改变

突变可能随时发生在这些遗传物质的任何地方，一般来说，基因可以简单的理解为DNA，对于一个基因而言，又可以简单的分为两部分：调控区和编码区（讲解部分-编码区点突变），前者负责在发育过程中的适当时间启动或关闭/抑制基因的转录，后者携带功能分子（通常是蛋白质）结构的遗传密码。蛋白质通常是由数百个氨基酸组成的链。细胞产生 20 种常见的氨基酸，正是这些氨基酸的独特数量和序列赋予了蛋白质特定的功能。每个氨基酸都由 DNA 中四个可能的碱基对中的三个（A-T、T-A、G-C 和 C-G，指的是四个含氮碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）中三个的独特序列或密码子编码。因此，改变DNA序列的突变可以改变氨基酸序列，从而可能降低或灭活蛋白质的功能。基因调控区域的DNA序列的变化会对基因蛋白质的时间和可用性产生不利影响，并导致严重的细胞功能障碍。另一方面，许多突变是沉默的，在功能水平上没有显示出明显的效果。一些沉默的突变存在于基因之间的DNA中，或者它们属于不会导致显着氨基酸变化的类型。

1.3 基因常见突变类型

基因突变经常发生，这并不奇怪，因为人体中有数十亿个细胞在不断分裂，以取代老的、衰竭的细胞。大多数情况下，DNA复制或分离中的错误会被酶迅速修复，或者在它们造成持久损害之前就将细胞摧毁。逃过生物体的修复机制后，基因的突变就发生了，突变的类型主要有以下几种：

（1）互变异构（Tautomerism）：这发生在细胞核DNA复制的过程中。互变异构体是不匹配的核苷酸碱基对；

（2）脱嘌呤（Depurination）：当DNA中的脱氧核糖和鸟嘌呤或腺嘌呤的嘌呤碱基之间的键断裂时，就会发生这种化学反应。失去嘌呤碱基是一种常见的自发突变。

（3）脱氨作用（Deamination）：如果酶从氨基酸中去除一个氮基团，就会发生这种情况。

（4）转置和颠换（Transition and transversion）：这些突变是两种类型的DNA替换错误，涉及核苷酸碱基对的转换。

1.4 基因点突变类型

核苷酸数量或类型的变化称为点突变，点突变的影响范围从无害到威胁生命。当核苷酸碱基错配或重排序的变化不影响细胞功能时，被认为是沉默突变。新的氨基酸甚至可以发挥与它所取代的氨基酸相同的功能。现目前，点突变是很多前沿研究的热点，例如大规模测序，找到易感基因，然后根据易感基因再找到易感位点；蛋白的修饰，比如磷酸化、棕榈酰化、瓜氨酸化等等；这些数据的获得或者后续的验证，都是常规实验很难达到的。那么基因的点突变主要包含一下几种类型：

（1）错义突变（Missense mutation）：当编码区一个核苷酸被另一个取代时就会发生这种情况，导致致多肽产物的氨基酸序列改变，这种碱基的取代会干扰正常的蛋白质合成和功能。

（2）无义突变（Nonsense mutations）：编码区核苷酸的突变，产生了一个过早的终止密码子或者一个不编码任何氨基酸的密码子，这种突变会影响蛋白质的正常功能。

（3）移码突变（Frameshift mutations）：再编码区的突变过程中，插入或删除的核苷酸数量不是三的倍数（三个碱基是一个密码子），改变了突变下游基因部分的读取框架，导致其编码完全不同的蛋白质序列。

（4）同义突变（ Samesense mutation）​：DNA 片段中有时某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸。其原因在于该位置的密码子突变前后为间并密码子，及多个密码子编码同一个氨基酸。

突变的其它类型：拷贝数变异（Copy Number Variation Mutations）、染色体突变（Chromosomal Mutations）等，这些是一种更复杂、更大范围的突变，往往与疾病相关，但是从进化的角度来说，是好是坏，还需要时间上的考量，在这里就不再赘述。

2 点突变载体的构建（以突变人类TNF-α第100 氨基酸为例）

2.1 首先在NCBI下载人类TNF-α序列

（1）查询人类TNF-α基因

查询并定位基因：直接进去NCBI，数据库选择“Gene”，复选框输入“TNF-α human”，点击search即可获得数据库中收集的相关数据，如图1和2（选择人类的TNF-α基因即可）所示：

（图1 检索人类人类TNF-α基因）

（图2 检索到人类TNF-α基因，点击进入获得基因及氨基酸序列）

查询并定位基因mRNA和Proteins：根据提供的有关TNF-α human的信息，找到mRNA和Proteins，点击“NM_000594.4”进入到mRNA具体信息；

（图3 找到mRNA 和蛋白（Proteins）信息）

定位CDS区：基于上一步的操作，定位到具体的mRNA信息（NM_000594），并在同一页面找到该基因的CDS区，点击CDS即可获得CDS区的碱基序列；

  （图4 定位并获取CDS的碱基序列）

下载CDS碱基序列：通过点击图4的CDS，即可转到基因的编码区序列信息展示界面，其中整个编码区从ATG（起始密码子）-终止密码子（TAG），均别着色；将获得编码区序列保持到DNAstar的EditSeq软件中（如果已经下载了，直接将序列保持到txt文件中，并将后缀改为“.seq”即可）；

（图5 有背景的碱基即为整个编码区的序列）

 2.2 碱基及对应氨基酸的查询

打开保存的“.seq”文件：在这里需要使用到另外一个软件“DNAman”，打开DNAman软件，执行：file-open-找到需要分析的.seq序列，个人建议直接拷贝这个序列到DNAman输入框即可；

（图1 DNAman软件打开示意图）

 （图2 DNAman成功打开碱基序列示意图）

 碱基密码子翻译成氨基酸：点击图2中红色箭头指示的碱基翻译成氨基酸序列的功能按钮，即可完成密码子-氨基酸的改变（前提是要选中所有的碱基序列）；

（图3 碱基及氨基酸展示结果选中，我喜欢图中的这种设置，大家也可以自己喜欢的展示形式选择对应的展示选框）

（图4 碱基-氨基酸对应模式，红框标记的碱基和氨基酸是本次需要突变的位置）

2.3 突变信息的确定

突变氨基酸及碱基确定：本次突变的信息是将第100号氨基酸-G（甘氨酸GGG）突变为氨基酸-R（精氨酸CGG），那么我们只需要将298的碱基“G”突变为“C”即可;各位看官可以根据自己的实验进行相应的突变。

将原始数据中第298为碱基G改为C：

(图1 原始碱基的G改为C示意图)

2.4 突变引物的设计

对于突变引物的设计，我们需要两对引物实现基因的点突变，第一对引物（F1/R1）（可参考本公众号推文“基因过表达（Overexpression）引物（primer）设计+质粒图谱详解”）用于扩增整个CDS区，第二对引物（F2/R2）（该对引物不要遵循严格的引物设计规则，只需要保证突变的碱基被包括进去，长度大概在18-30bp之内）在点突变的位置进行设计，需要尽可能将突变点至于引物中间.PCR扩增过程中分为四步：第一步：F1-R1扩增获得TNF-α基因；第二步F1-R2;第三部F2-R1；第四步，将第二三步的PCR产物作为模板使用F1-R1扩增获得整个突变后的序列。

（图1 双引物PCR扩增突变基因序列示意图）

 3 结束。

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