三种点杂交教程---dot blot protocol

点杂交也叫斑点印迹实验（spot blot/dot blot）将蛋白样品/DNA样品/RNA样品点到尼龙膜或硝酸纤维素膜（NC）上，通过紫外交联/或者恒热干燥使样品吸附到尼龙膜/NC膜上，再通过探针杂交或者抗体吸附对样品进行定性定量分析。

目前斑点杂交按样品类型分主要有三种，核酸表观遗传修饰印迹（甲基化/羟甲基化印迹）、单链DNA/RNA印迹、蛋白斑点印迹。前两种都做过，第三类尚未尝试。

下图是近期自己文章的图，看多了长条带，看看这些圆点型条带感觉很舒适！

Sun D, Qin Z, Xu Y, et al. The IVF-generated human embryonic microenvironment reverses progestin resistance in endometrial cancer cells by inducing cancer stem cell differentiation. Cancer Lett. 2022;526:311-321. doi:10.1016/j.canlet.2021.11.003。

甲基化/羟甲基化印迹

甲基化/羟甲基化都是表观遗传修饰，DNA和RNA的表观遗传修饰在不改变DNA/RNA顺序的情况下，对个体生长、发育、基因表达、衰老发生和肿瘤发生中发挥了重要调控作用。点杂交是检测甲基化/羟甲基化水平的重要手段，像5mC、5hmC、m6A等都能用点杂交检测修饰水平。下面以DNA 5hmC 点杂交为例子，解析检测流程：

1. 样品制备：甲基化和羟甲基化是化学基团修饰，所以可以用DNA提取试剂盒进行DNA提取，也可以用粗提法进行DNA提取，提出的DNA溶解于200ul左右的TE缓冲液中，200ul是为了超声方便，并且浓度不至于过低；
2. 片段化：将DNA放冰浴中以70W进行超声处理1分钟（不计算超声间断时间），使片段大致处于1000-3000bp左右（如果用10ul小枪吸打DNA没有粘稠感可以不超声）；
3. 稀释：检测DNA浓度，用弱碱性TE缓冲液稀释DNA至50-200ng/ul；（抗体包装写0.5ng/ul都可以检测到，然而我做的时候浓度低于50都受背景干扰）
4. 变性：将稀释好的DNA加热至95℃变性10min，冰浴5min（提取DNA时有彻底除去DNA交联的蛋白步骤，此步可略过）。
5. 点样：裁一张大小合适的滤膜，用枪头盒里的板/8联管板压住膜（起固定膜以及把控样品间距的作用），移液枪尖端侧靠着板孔，将1-2µlDNA样品点到硝化纤维素膜上，所有样品干燥后，取走固定板；
6. DNA固定：如果使用硝酸纤维素膜，将点好的膜放入盒子中，置60℃烤1-2h；如果使用尼龙膜，样品在膜上还有水印时便应进行紫外交联，1500J/5min（点上去放太干，膜上的DNA甚至会被吹走）；
7. 封闭：用1%的牛奶封闭/1%牛血清蛋白/含3% BSA的TBS-T封闭10min；
8. 一抗结合：将膜放入用BSA/TBS-T稀释好的一抗中4℃过夜孵育（甲基化5mC，羟甲基化5hmC，RNA m6A等）；
9. 清洗表面多余抗体溶液：用TBS-T清洗三次，每次5min；
10. 二抗结合：在室温下与二抗孵育30min；
11. 清洗表面多余抗体溶液：用TBS-T清洗三次，每次5min；
12. 显影：用ECL试剂孵育1分钟，显影、曝光；
13. 清洗表面ECL：用TBS-T清洗曝光后的膜2min，将膜置于吸水纸上吸干（有微微水印，不可太干）；
14. 内参染色：用无菌水稀释美兰溶液至10%，将条带泡美兰溶液中10s左右捞出，流水清洗，直至背景变浅，点样区被染上颜色，拍照记录，作为内参。

↑RNA 甲基化参考：

Xiang Y, Laurent B, Hsu CH, et al. RNA m6A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response [published correction appears in Nature. 2017 Nov 29;:]. Nature. 2017;543(7646):573-576. doi:10.1038/nature21671。

DNA/RNA探针点印迹（与southern blot/northern blot类似）

DNA/RNA探针点印迹是利用单链DNA/RNA与另一互补单链探针互补配对，定性定量检测单链DNA/RNA的方法，这里主要讲DNA探针点杂交：

1. 片段化：将chip沉淀下来的DNA或总DNA进行超声片段化，70W进行超声处理3分钟；
2. 变性：用0.4 M NaOH微碱溶液稀释溶解DNA，放PCR仪95℃加热变性3min，立即冰浴；
3. 点样：裁一张大小合适的滤膜，用枪头盒里的板/8联管板压住膜（起固定膜以及把控样品间距的作用）移液枪尖端侧靠着板孔，将1-2µlDNA样品点到硝化纤维素膜上，所有样品干燥后，取走固定板；
4. DNA固定：如果使用硝酸纤维素膜，将点好的膜放入盒子中，置60℃烤1-2h；如果使用尼龙膜，样品在膜上还有水印时便应进行紫外交联，1500J/5min（点上去放太干，膜上的DNA甚至会被吹走）；
5. 预热：用无探针杂交液50℃预热并浸湿膜；
6. 探针杂交：将膜加入含探针杂交液中至于杂交炉中50℃摇动孵育4小时或42℃过夜；
7. 清洗：将膜放入2xSSC清洗液中洗涤2min；
8. 封闭：将膜转到3% BSA的TBS-T封闭10min；
9. 清洗：将膜放入2xSSC清洗液中洗涤5min；
10. 二抗孵育：TBS-T稀释二抗，孵育30min，如果探针偶联上的是生物素，选择HRP二抗；如果探针偶联上的是地高辛，需要选择抗DIG的一抗先孵育，清洗，再孵育二抗（AP、HRP）二抗；
11. 清洗：将膜放入2xSSC清洗液中洗涤5min，重复三次；
12. 显影：用ECL试剂孵育1分钟，显影、曝光；
13. 清洗表面ECL：用TBS-T清洗曝光后的膜2min，将膜置于吸水纸上吸干（有微微水印，不可太干）；
14. 内参染色：用无菌水稀释美兰溶液至10%，将条带泡美兰溶液中10s左右捞出，流水清洗，直至背景变浅，点样区被染上颜色，拍照记录，作为内参。

Shiromoto Y, Sakurai M, Minakuchi M, Ariyoshi K, Nishikura K. ADAR1 RNA editing enzyme regulates R-loop formation and genome stability at telomeres in cancer cells. Nat Commun. 2021;12(1):1654. Published 2021 Mar 12. doi:10.1038/s41467-021-21921-x。

蛋白斑点杂交：

蛋白斑点杂交(Dot Immunobinding Assay，DIBA)，将抗体或抗原点到硝酸纤维素膜/醋酸纤维素膜固相支持物上，进行免疫学反应检测的方法。已较多地应用于医学基础研究和疾病的诊断，比如一些ELISA试剂盒，病毒检测试剂盒等。

1. 剪膜：准备好硝化纤维素膜，用枪头盒里的板压住膜（起固定膜以及把控样品间距的作用）；
2. 点样：移液枪尖端侧靠着板孔，将2µl样品点到硝化纤维素膜上（点样量尽量不超过5ul减少溶液穿透的面积）；
3. 样品固定：让薄膜自然干燥或至于洁净的37℃烘箱烘干（看不到水渍印后再放2min）；
4. 封闭：将膜致于孵育盒中，用含5% BSA的TBS-T溶液室温封闭30min至1h；
5. 一抗结合：将膜放入用BSA/TBS-T稀释好的一抗中孵育，室温下孵育30min；
6. 清洗表面多余抗体溶液：用TBS-T清洗三次，每次5min；
7. 二抗结合：在室温下与二级（HRP）抗体结合孵育30min；
8. 清洗表面多余抗体溶液：用TBS-T清洗三次，每次5min；
9. 显影：用ECL试剂孵育1分钟，显影、曝光；将未知样品的信号与标准品的信号进行比较，并估计浓度。

（洗涤液：含0.5％Tween20的0.01M PBS PH7.4，封闭液(抗体稀释液)：1M D-glucose 19.817g，2ml 甘油(2％)加含0.35％ Tween20的0.01M PBS至100ml）

蛋白斑点杂交很多已经设计成试剂盒，大家需要可以自行上网查看。