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[求助]怎么PCR老是做不出来结果

发布于 2005-11-17 · 浏览 899 · IP 美国美国
这个帖子发布于 19 年零 203 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
:(老板要将CYP1B1蛋白全长克隆出来,并编排到一个表达载体中,该蛋白cDNA的全长序列在网站

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=Nucleotide&dopt=GenBank&val=13325059

LOCUS NM_000104 5128 bp mRNA linear PRI 16-OCT-2005

我先设计一组引物,分别为
5’-primer: 5'-AATTAAGATCTTATGGGCACCAGCCTCAGCCC-3' 位置在309-328
3’-primer: 5'-CCGTGTCGACTTATTGGCAAGTTTCCTTGGC-3' 位置在2155-2174
当然,5'端加了约10个bp的碱基用作酶切位点和保护碱基,但反复从细胞的cDNA库中只能扩增出约1100kb的条带,而全长条带引该是1629bp;

后设计第二组引物,
5’ primer:5‘-CACTGGAAACCGCACCTC-3‘, begin at 347bp
3’primer:5’-TTGCCTCTTGCTTCTTATTGG-3‘, end at 2018bp
the whole length is 1672bp.

扩增程序为:Denaturing step at 94°C 3 min. And then Denaturing step at 94°C 50 sec, annealing at 58°C 40sec, and extension at 72°C 90 sec for a total of 35 cycles. After the last cycles, mixture maintain 5 min. and then, stop the reaction, store mixture at 4Cº。

但反复扩增,只能在胶上看到约80~90kb的引物二聚体,看不到其他带,两张图片附如下,请教各位高手,我是那步有问题。

非常感谢各位大侠的赐教。
img





















最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 899

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