protocol 分享｜海马组织蛋白提取
简介
蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。
因此，研究蛋白质的结构和功能对于理解生命体的基本机制和开发新药物具有重要意义。蛋白质提取是研究蛋白质的基础步骤之一。
原理
RIPA 裂解液是一种传统的可用于裂解细胞或组织的快速裂解液，其原理为利用表面活性剂等裂解细胞膜（包括核膜），从组织或细胞中抽取可溶性蛋白。RIPA 裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常规的 WB、IP、co-IP 等实验。
用途
PAGE、Western、免疫沉淀 (immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀 (co-IP) 和 ELISA。
材料与仪器
离心机（提前降温为 4 ℃）、制冰机
匀浆机、碎冰、双蒸水、50 ml 离心管若干
过滤纸、计时器、预冷的 PBS
RIPA 裂解液、磷酸酶抑制剂
蛋白酶抑制剂
步骤
从小鼠海马组织中提取蛋白质的步骤如下：
1、配裂解液：取裂解液 RIPA 解冻，小鼠每个标本需 150 μl，或直接标本称重，根据体积加裂解液 1:10 = 10mg:100ul，根据样本数计算所需总量，配好后放置冰上。根据上面计算好的裂解液，将蛋白酶抑制剂加入裂解液中；
2、将裂解液加入标本：标本中加入配置好的裂解液，每个标本各加入两颗匀浆蛋白珠（蛋白珠洗净），放置冰上，待匀浆；
3、匀浆：清洗匀浆机头，将放有裂解液+蛋白酶抑制剂的标本匀浆打三次（每次 1 min）充分混匀，完成后清洗匀浆机头 2～3 次，将匀浆机头放回 -20 ℃ 冰箱保存；
4、将标本放在冰盒中置于摇床上摇 30 min，低速，促进裂解；
5、离心：4 ℃，12000 rpm，20 min，离心标本（离心机提前降温准备）；
6、取上清至另一 EP 管，放置冰上；
7、上清根据实验目的分装后放置 -80 ℃ 保存。
注意事项
1. 蛋白提取的全程要在低温环境下进行，以防止蛋白降解；
2. 取上清液时不一定有沉淀，取上清，宁少勿多；
3. 组织取材后最好分装，避免反复冻融；
4. 根据实验目的选取裂解液。如，目的蛋白是膜蛋白，可以选取 NP40 浓度稍高的裂解液，改变裂解液中的盐离子浓度；
5. 建议提前搜索目的蛋白的丰度，根据实验用量计算组织使用量。
常见问题
1. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？
答：可以，甚至可以同时测十几种样品。
2. 蛋白提取后可以存放多久？
答：-80 ℃，一年没有问题。但不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌污染。组织取材后最好分装，避免反复冻融。
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最后编辑于 2023-06-13 · 浏览 1555
