protocol 分享｜亲和层析实验（详细步骤解析）

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亲和层析是通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的一种层析方法。包括基于空间结构特异结合的抗原/抗体，酶/底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，激素/受体，核酸/核酸结合蛋白、互补核酸序列，和基于电子的供体和受体相互作用的金属螯合、嗜硫亲和等。

一、材料

样品；亲和层析柱；结合缓冲液；洗脱缓冲液。

二、步骤

①准备层析柱，根据目标蛋白量和填料载量确定柱体积；

② 准备样品，通过过滤或离心除去颗粒性物质，确保样品中不含干扰结合的物质，根据不同的亲和层析类型调整上样缓冲液 pH；

③ 上样前用上样缓冲液平衡柱子或珠子，柱子需根据结合能力强弱确定上样流速；

④ 孵育，对于亲和磁珠需将样品、抗体、珠子 4℃ 孵育一段时间后再进行洗脱；

⑤洗脱，对于组蛋白标签蛋白采用咪唑或低 pH 盐溶液洗脱、对于 GST 融合蛋白采用含 10-20 mM 还原性谷胱甘肽的溶液洗脱、对于金黄色葡萄球菌蛋白 A 采用低 pH 盐溶液洗脱；

⑥ 对于亲和层析柱可以用结合缓冲液重新平衡柱子或用储存液冲洗柱子，再生利用。

三、常见问题

1、Ni 柱进行蛋白纯化需要注意什么?

缓冲液中不能有高浓度的电子供体基团、不能有强螯合剂、不能有高浓度强还原剂、不能含离子型去垢剂、避免含碳酸氢钠等物质；

2、GST 蛋白纯化需要注意什么？

避免蛋白样品超声太剧烈或时间过长引起的蛋白变性，增加洗脱缓冲液的 pH 值可在不增加还原谷胱甘肽浓度的情况下提高洗脱效率；

3、Protein A 纯化蛋白需要注意什么？

要保证 Protein G 和抗体有充分的结合时间，抗体纯度不够会导致杂蛋白含量高、易引起蛋白沉淀。

参考来源：Hage, David S., and Jack Cazes. Handbook of affinity chromatography. CRC Press, 2005.

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