DNA甲基化原理

DNA甲基化(methylation)是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体,将DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基,主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)(常见于基因的5'-CG-3'序列)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)结构基因含有很多CpG 结构, 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60%～90%的CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点,以及DNA 酶的敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性。5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能导致基因置换突变,发生碱基错配:T2G,如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化的方式是稳定的,可遗传的。

在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,在哺乳动物中mC约占C总量的2-7%。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式,能在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。为外遗传编码(epigenetic code)的一部分,是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上,例如在胞嘧啶环的5'碳上:这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内,大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中,DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸(CpG dinucleotide)部位;而非CpG甲基化则于胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG(或CpNpG),或是不对称的CpNpNp形式(C与G是碱基;p是磷酸根;N指的是任意的核苷酸)。特定胞嘧碇受甲基化的情形,可利用亚硫酸盐定序(bisulfite sequencing)方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化,进而使其失去功能。此外,也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。

二、DNA 甲基转移酶分类

DNA 甲基转移酶有两种:

(1)DNM T1,持续性DNA 甲基转移酶——作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链,使其完全甲基化,可参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化,DNM T1可能直接与HDAC(组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录;(2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶,它们可甲基化CpG,使其半甲基化,继而全甲基化。从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控,其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。

DNA去甲基化有两种方式:

(1)被动途径:由于核因子NF粘附甲基化的DNA,使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化,从而阻断DNM T1 的作用;(2)主动途径:是由去甲基酶的作用,将甲基集团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中,甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、NF2κB、Cmyb、Ets, 使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录,但是,甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1) ,使它们失活,从而阻断转录。人们已发现5 种带有恒定的甲基化DNA 结合域(MBD)的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3参与甲基化有关的转录阻遏;MBD1有糖基转移酶活性,可将T从错配碱基对TöG中移去,MBD4基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2缺陷的小鼠细胞中,不含M ECP1复合物,不能有效阻止甲基化基因的表达。这表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的选择,以及DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用。

三、DNA甲基化检测方法:BSP

1、甲基化检测方法原理

亚硫酸氢钠处理后测序法 (bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理,用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测,并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点,可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。

重亚硫酸盐处理过程示意图

DNA经重亚硫酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶不变,未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。

甲基特异性的PCR扩增(MS-PCR)示意图

2、甲基化检测方法具体实验步骤:

第一部分 基因组DNA的提取

这一步可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节:

1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;

2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二:

1:紫外分光光度计计算OD比值;

2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

建议琼脂糖凝胶电泳检测:琼脂糖凝胶电泳完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

双蒸水(DDW)经高压蒸汽灭菌。

1、将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;

2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;

3、42℃水浴30min;

水浴期间配制:

4、10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)

5、3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6、EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。

7、加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。

8、50℃避光水浴16h。

注意:

(1)基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。

(2)所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。

(3)亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

(4)水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。

第三部分 修饰后DNA纯化回收

EP管为高压蒸汽灭菌的。

1、将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。

2、按照试剂盒操作要求进行修饰后DNA纯化回收

第四部分 修饰后DNA用于PCR

按照正常PCR操作进行即可,但需注意以下几点:

1、引物问题:如果时间充裕、做的又是比较新的基因,文献不多,自己设计引物。如果时间紧迫,可以选择参考文献。首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,可以直接联系咨询。查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强。

2:Taq酶问题:体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶就可以。

3:PCR的条件:变性一般都选择95度,3min。其余根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。

4:做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行。

5:PCR仪:如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙会影响温度的传递。

第五部分 PCR产物的凝胶回收

可以使用凝胶PCR产物回收试剂盒,把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节:

1、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

2、凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性。

3、紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤。

4、回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的。

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选

1、连接T载体(Promega的试剂盒)

15ul体系:T-easy 1ul;Ligase 1ul;2xbuffer 7.5ul;DNA 5.5ul,4度,过夜。

2、连接产物的转化

1)-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上;

2)连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟;

3)42度,90秒钟;

4)冰上2分钟;

5)800ul LB培养基;

6)280rpm,37度,摇床45分钟;

7)8000rpm,1分钟;在超净台内去上清,留100-150ul;

8)涂板:37度孵箱过夜;(板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基)

先涂:X-gar 35ul、IPTG 25ul

后涂:混悬液

过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低。

3、取白斑,划种于新板上

新板:先涂:X-gar 35ul、IPTG 25ul

然后于板底划出分区,进行标记。根据需要,一般一板作50个克隆没有问题。

针头挑白斑划2道于板上相应区域内。

37度,孵箱过夜。

4、联系测序公司送测序。

这一部分的细节:

1:涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上;

2:不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个。