体外诊断中的核酸提取纯化方法及原理介绍

目前，新冠疫情在全球席卷开来，对于如何确认是否感染，使用体外诊断核酸检测方法仍是不可或缺的手段。

体外诊断，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。

而检测人体样本的关键步骤之一，即是样本中的核酸（DNA和RNA）纯化。核酸纯化的方法是影响所提取核酸质量的重要因素，只有高质量的核酸才能满足下游的各种应用。

核酸是分子生物学的基础，而核酸提取是核酸检测，乃至于整个分子行业绕不过去的门槛，很多时候一份样本的核酸提取的好坏直接决定了检测结果的有效性。

01、核酸的基础知识

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。

DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。

02、为什么需要核酸提取？  

核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术），获得的核酸可以多种方式进行应用。

准确的研究目的，决定了要提取的核酸类型；核酸的应用往往影响提取方法的选择。（例如：标准的End-point PCR反应，不需要与全基因组测序实验相同的DNA质量）

为了确定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游应用以及任何与样品类型相关的潜在限制。（例如，临床样品采集量往往有限，核酸提取存在挑战。）

虽然依据样品类型，细胞裂解方式不同，但整体的核酸提取核心原则不变：细胞或组织样品裂解，去除非核酸污染物（例如，蛋白质等）。

03、核酸提取纯化原则和要求

1、保证核酸一级结构的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）

3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

   4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；

   5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

04、常见核酸提取纯化方法

01、苯酚氯仿抽提法 

苯酚和氯仿均为有机溶剂，其萃取核酸原理是苯酚与氯仿对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用，但对核酸本身没有影响。经离心后，形成上层水相下层酚/氯仿相，变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层，而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相；同时，氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后，再将核酸通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。

此法的缺点是：

(1)  蛋白质难以彻底去除；

(2)  操作难度大且费时；

(3)  使用危险化学品。 

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

02、离心柱纯化

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱，将核酸从吸附膜上脱离，即可得到纯化后的核酸。离心柱纯化也是的试剂盒提取中广泛的使用方法。

但即便如此，离心柱纯化法仍存在缺点：

（1） 高度依赖吸附膜的结合能力；

（2） 洗脱不完全导致核酸流失；

（3） 无法大量提取核酸。

离心柱纯化法示意图

03、磁珠法核酸分离技术

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA（例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备）。一般而言，将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

不同类型基因检测均会涉及到核酸的提取和纯化步骤。核酸提取纯化的方法中，液体法和离心柱法均会涉及到有毒有机物的使用，对环境和实验操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相应特殊配制的磁珠缓冲液和特异修饰后的磁珠，从成本和操作方面来分析，均存在成本高且操作步骤繁琐，同时，也限制了自动化的进程和应用的推广。因此，开发一种能快速释放核酸并且对后续基因检测实验无影响核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。

针对现有技术存在的问题，先达基因提供一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用，能够大大缩短核酸提取纯时间化、降低制造成本，同时具有操作简单的优势。

04、核酸快速释放技术

DNA释放剂

本次介绍苏州先达基因的DNA释放试剂盒，专用于从各种常见的样品中快速释放恒温荧光扩增的 DNA，具有以下特点：

1. 核酸释放剂可以快速裂解样品，使样品的 DNA 游离在溶液中。无需自备任何试剂，不使用苯酚、氯仿等有毒试剂。

2. 操作简单，只用一步（约 3min）即可得到用于恒温荧光扩增的 DNA 模板，不需要任何离心、抽提等操作步骤。

3. 全过程仅在一个离心管内完成，避免微量样品的损失，且不容易交叉污染，比常用的抽提试剂盒简单，方便。

4. 兼容性广，适用于常见的分子生物学样品，包括细菌、昆虫、各种动物组织、口腔细胞、毛发、组织中的细菌和病毒等。 

DNA释放剂使用方法

应用领域：

生命科学研究、分子诊断、动物疫情检测、食品安全检测、疾控/突发传染病检测、精准用药基因检测

RNA快速提取试剂盒

本试剂盒是先达基因为匹配现有的ERA等温扩增技术，着力为实现分子诊断POCT化而自主开发的一款核酸快速提取产品。本产品可在5min之内快速完成对组织、血液、拭子、细胞等不同少量以及微量样品中病毒的RNA提取和纯化。利用本产品提取获得的RNA可直接应用于核酸扩增及检测、体外逆转录、基因克隆、文库构建、杂交等多种生物学实验及研究。

特点：

5分钟内即可快速提取和纯化得到高品质的RNA；

样本要求量低，RNA提取产量可达到25ug；

操作简便，只需5个操作步骤；

不含酚/氯仿等有毒有害试剂。

RNA快速提取流程图

目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点，例如:酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其主要成分对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染；磁珠法因提取成本较高，从而限制了广泛应用。

先达基因的试剂用于生物样本病毒DNA提取，样本需求量少、操作简便、无需繁琐的离心、洗脱等步骤，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有操作简便、使用安全、成本低的优点，适合在临床基因检测中推广应用。