请教老师瞬转问题

想问问老师，构建质粒测过序后，做瞬时转染72h收蛋白，但是PCR就高表达10多倍，wb没有明显高表达，最高一次40%，其他都是10-20%，甚至没有差别。有同学同样做瞬时转染pcr都1000多倍，wb也一倍多。转染试剂lipo3000,但是转染的siRNA有明显低表达。做了快两个月了一直是这样。但高表达一直不明显。wb上样量15ug，转膜200mA,30min,目的蛋白12kDa。质粒是自提的，上次跑核酸电泳胶发现RNA残留，但最近一次加了RNA酶,（没有跑核酸电泳）还是没有高表达。

我想问的问题是1.质粒构建会不会构建错误。质粒是pcDNA3.1- 酶切位点插入CDS段方向 启动子↣CDS首段↣CDS末端

2.wb阳性结果（有资料说差别80-90%才有意义）很困惑

3.不明白同样是瞬时转染，同学的高表达为什么这么明显，真的是很羡慕。

感谢各位老师。