药物递送（六）——白蛋白纳米粒技术

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2005年1月7日，FDA批准紫杉醇白蛋白结合纳米粒Abraxane用于治疗联合化疗失败后的转移性乳腺癌，成为全球首个白蛋白纳米粒药物递送技术的成功案例。2012年10月，FDA又批准Abraxane联合卡铂用于不适合治愈性手术或放疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的一线治疗。一时间，白蛋白纳米粒药物递送技术“洛阳纸贵”，国内先后上市了四款仿制药。

文丨塔卡拉玛干的白杨

一、概 述

1. 白蛋白概述

白蛋白（Albumin），又称清蛋白。人血清白蛋白是含有三个同源的α-螺旋结构域的螺旋状蛋白，三个结构域聚集在一起形成不对称的心形结构。结构域是由疏水性和带正电荷的基团所形成的袋状结构，每个结构域中包含两个亚级结构域，每个亚级结构域又由6个螺旋结构所组成的。

图1 白蛋白的结构

白蛋白能维持稳定的血浆胶体渗透压，保证细胞内液、外液和细胞液间的交流，其黏性和胶质性能保护球蛋白，同时又能络合重金属离子，发挥解毒作用。白蛋白含有游离巯基和八个二硫键，水溶性良好。最重要的是，白蛋白是非专属转运蛋白，能与难溶性或者外源性物质形成复合物，成为这类物质在血液循环中的“轮渡”。运输能力加上其生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性，使其可作为药物递送的载体。

除此以外，白蛋白也能靶向于肿瘤细胞。由于肿瘤细胞的快速繁殖需要大量的营养物质，而白蛋白正好可以能提供氨基酸和能量，使得肿瘤细胞表面存在白蛋白结合受体Gp60（分子量为60kDa的糖蛋白）。当白蛋白作为递送载体时，能与Gp60受体靶向结合，再与细胞内蛋白质（caveolin-1）结合，细胞膜内陷形成转运囊泡，使药物递送系统与肿瘤细胞中过表达的富含半胱氨酸的酸性分泌型蛋白（Secreted proteinacidic and rich in cysteine SPARC）结合，白蛋白载体在肿瘤内蓄积，实现靶向药物递送。

图2 白蛋白靶向递送

2. 白蛋白的种类

（1）人血清白蛋白（HSA）

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）在人体血清中的含量高达35~50mg/ml，约占血浆总蛋白的50%，为一种含有585个氨基酸的单肽，半胱氨酸含量高，色氨酸含量低。

人血清白蛋白由肝实质细胞中的单基因翻译成前清蛋白原，前清蛋白原的N端前肽被内质网中的丝氨酸蛋白酶裂解，形成清蛋白原，清蛋白原被输送到高尔基体中，高尔基体中的弗林蛋白酶将清蛋白原转化为分子量为65–70 kDa的白蛋白。合成后的白蛋白立即释放到体循环中，半寿期约为15-19天。

市售人血白蛋白注射液经两次60℃、10小时加热灭活病毒处理，用于失血、创伤及烧伤等引起的休克，脑水肿及大脑损伤所致的脑压增高，防治低蛋白血症、新生儿高胆红素血症、低蛋白血症及肝硬变或肾病引起的水肿和腹水，用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征。

图3 人血清白蛋白

（2）牛血清白蛋白（BSA）

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白,包含583个氨基酸残基，分子量为69kDa。牛血清白蛋白与人血清白蛋白类似，因其良好的生物相容性、生物降解性、无毒和无免疫原性，而被广泛用于药物递送技术。

目前有用牛血清白蛋白制备他克莫司和多西他赛白蛋白纳米粒的相关文献。以他克莫司牛血清白蛋白纳米粒为例，该递送系统先速释后缓释，并且药物在体内循环时间延长，药物清除速率变慢。

与人血清白蛋白不同的是，因其来源于动物，可能引起的免疫应答是限制其临床应用的主要因素，但牛血清白蛋白是替换人血清白蛋白的主要选择之一。目前主要作为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，也作为营养物质被广泛用于细胞和微生物培养。

（3）卵白蛋白（OVA）

卵白蛋白即卵清蛋白（Ovalbumin，OVA），为一种单体磷糖球蛋白，由365个氨基酸组成，分子量在42~47 kDa之间。卵白蛋白易被免疫系统识别，可用于抗原递送。卵蛋白的表面活性功能使其能用于制备乳剂、凝胶和泡沫，并且对酸碱度和温度敏感，适合用于药物递送。相比于其他白蛋白，卵白蛋白更为经济。

在相关的应用中，有将卵清蛋白与其他聚合物材料联合使用，可以增加主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）的表达和T细胞的激活，这个特点可用于靶点CD88的疫苗递送。

市售的卵白蛋白口服液，主要用于免疫调节，能预防低蛋白血症，增强人体免疫力，改善贫血。

图4 卵蛋白口服液

（4）鼠血清白蛋白（RSA或者MSA）

鼠血清白蛋白由608个氨基酸残基组成，分子量约64.3kDa，结构与其他血清蛋白类似，根据来源可分为小鼠血清白蛋白（Mouse serum albumin，MSA）和大鼠血清白蛋白（Rat serum albumin，RSA）。目前鼠血清蛋白主要在抗体制备过程中作为载体用于偶联半抗原，尚无其他药物递送的应用。

二、白蛋白载体

人血清白蛋白作为药物递送系统，有如下优势：

（1）生物相容性好。白蛋白作为内源性物质，相容性较好，无毒，无抗原性，代谢产物安全，不会引发自身免疫反应，也不会有其他不良反应；

（2）稳定性好。白蛋白在一定的温度和酸碱度下能保持良好的稳定，对于大多数外源性药物，白蛋白通过对其包载提高稳定性；

（3）载药性能好。白蛋白独特的空间结构，能通过物理包埋或者化学键合的方式包载药物。已有数据表明，白蛋白可以增加疏水性药物在血浆中的溶解度，并且能较好地保护易氧化药物；

（4）具有靶向性。白蛋白可以躲避网状内皮系统的识别与吞噬，同时因为白蛋白表面的结合位点多，可以通过表面修饰实现对受体的靶向递送；

（5）体内半衰期时间较长。白蛋白在血液中呈现负电荷，使其不易被巨噬细胞清除，延长递送系统在循环系统的时间。

1. 白蛋白纳米粒（Albumin based nanoparticles）

白蛋白纳米粒，是将药物包载于白蛋白纳米粒递送系统中，药物可以通过共价结合在白蛋白的空间结构内，也可以通过物理吸附附着于递送系统的表面，目前也有更先进的技术将药物掺杂入纳米粒的基质中。如果药物吸附于递送系统的表面，存在一定的稳定性和安全性隐患，毕竟物理吸附并非紧密连接。而共价结合于白蛋白的三维结构内或者掺杂于基质中，则能保证药物分子在整个产品周期内不被降解。

白蛋白纳米粒递送系统的最大优势是药物负载量的显著提高。因为药物包载于内部，结合位点的多少不会对载药量造成显著影响，二硫键的打开与闭合才是载药量的关键因素。该递送系统的转化难点在于粒径的控制，如果选用过滤除菌来控制产品无菌度，刚性白蛋白纳米粒的尺寸是影响收率的最关键参数。

图5 白蛋白纳米粒递送示意图

2. 白蛋白结合纳米体（Albumin conjugated nanobodies）

白蛋白结合纳米体，实质是白蛋白结合抗体的功能化片段。单克隆抗体能得以广泛普及，是因为抗体能特异性靶向肿瘤部位，与肿瘤细胞上过度表达的受体相结合，抑制与肿瘤细胞生长和存活相关的生长因子。但单克隆抗体的尺寸较大，肿瘤渗透能力较差。常用方法是将单克隆抗体上的功能化片段剥离出来，该功能化片段即是纳米体。这些纳米体与白蛋白结合后，延长半衰期，同时增强针对多肽抗原的免疫应答。

图6 白蛋白结合纳米体示意图

3. 白蛋白-药物结合物（Albumin‑drug conjugates）或白蛋白结合前药（Albumin‑binding prodrugs）

白蛋白-药物结合物是指药物和白蛋白之间通过分子连接形成白蛋白化药物。白蛋白的赖氨酸残基是连接药物的重要官能团，在交联剂的作用下，药物与白蛋白的游离氨基发生连接形成结合物。

第一个被研究的白蛋白-药物结合物是1997年通过直接偶联法制备的甲氨蝶呤-白蛋白结合物(MTX-HSA)，整个结合过程在制备过程中完成。在此基础上，后来开发了白蛋白结合肽和前药，可以快速和选择性地结合到外源性和内源性白蛋白的半胱氨酸-34位游离巯基上。以内源性白蛋白的前药设计为例，前体药物静脉给药后快速并专一性地与循环白蛋白半胱氨酸-34位游离巯基结合，在血液中形成大分子运输形式。

相比纯度不够的外源性白蛋白，内源性白蛋白的巯基（其他体液蛋白几乎没有游离巯基）与药物结合更容易。将前体药物与在体白蛋白结合，在结合位点之间引入可断裂的化学键，确保药物在酸性肿瘤微环境中被裂解或通过肿瘤特异性蛋白酶特异性释放，并让游离药物能更加充分发挥药理作用。

图7 白蛋白结合前药

4. 白蛋白融合蛋白（Albumin fusion proteins）

白蛋白融合技术，是一种经一步技术得到均匀产品的技术，实质是将白蛋白与编码活性蛋白药物的基因融合产生转位蛋白。该蛋白融合技术最初用于类似天然蛋白衍生化，通过增加分子量来延长体内半衰期，降低给药频率。在后来的深入研究中又发现延长半衰期的新机制，白蛋白的引入使蛋白类药物能抵抗蛋白酶的降解作用，且减少了致敏几率。

白蛋白融合技术的开发以Human Genome Sciences公司为例，该公司利用蛋白融合技术开发了多种长效型蛋白类药物，比如人血白蛋白融合α-干扰素基因（ZALBIN^TM）、人血白蛋白融合胰高血糖素样肽（Syncria）、人血白蛋白融合α干扰素（Albuferon-α^TM）。在Albuferon-α^TM的III期临床试验中，药物半衰期显著延长，给药间隔延长到2-4周，极大地提高了顺应性。

图8 白蛋白融合蛋白

除了以上这些白蛋白递送技术外，由于白蛋白表面具有多个功能基团，通过修饰连接相应配体，可以实现特异性靶向递送，所以白蛋白表面修饰也是研究热点之一。

尽管白蛋白被广泛研究，但真正被广泛应用于临床上的还是白蛋白纳米粒，因此，本文的后续内容仅介绍白蛋白纳米粒递送技术。

图9 白蛋白纳米粒表面修饰

三、制备技术

白蛋白纳米粒的制备方法有：去溶剂法、乳化法、自组装法、凝胶法、喷雾法和Nab^TM技术。

图10 白蛋白纳米粒制备技术

1. 去溶剂法（Desolvation）

去溶剂法（Desolvation）的实质是利用白蛋白在有机溶剂和水溶液中理化性质的差异来形成白蛋白纳米粒。水溶性的白蛋白不溶于有机溶剂，甚至会在有机溶剂中变性聚集，形成沉淀。

去溶剂法常见的制备过程是将有机溶剂滴入到白蛋白溶液中，随着有机溶剂比例的增加，白蛋白的溶解度下降，导致变性和聚集。这一步也有描述为作为脱水剂的有机溶剂除去白蛋白的水化膜，使白蛋白的疏水性区域暴露而析出。此时加入交联剂，白蛋白侧链上赖氨酸残基的氨基部分和精氨酸的胍基部分与醛基发生缩合反应，从而固化白蛋白形成纳米粒。最后除去有机溶剂和残留的交联剂，对纳米粒进行纯化，收集白蛋白纳米粒。

有机溶剂（脱水剂）是该制备方法的关键因素之一。有机溶剂的比例与纳米粒的粒径极为相关，高比例的有机溶剂加快白蛋白的脱水速度，形成的纳米粒子粒径较大。常用的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮等等，其中甲醇因较高的介电常数，使有机溶剂和水性介质混合物的极性变化极为缓慢，形成的粒径小于100nm，而选用丙酮时形成的白蛋白纳米粒的粒径在140~300nm范围内。

交联剂的选择是该制备方法的另一个关键因素。交联剂决定着纳米粒子的稳定性、生物降解性和药物递送系统的释放度。因戊二醛交联的纳米粒物理特性良好，被作为交联剂广泛使用，但戊二醛在很多细胞系中表现出细胞毒性和基因毒性，导致制备的产品因安全性考虑无法使用于临床。其他潜在的交联剂有葡萄糖、甲醛，或者谷胱甘肽交联白蛋白的二硫键。另外的一种策略是选用物理交联方法，比如干燥、加热、紫外辐射。

去溶剂法多适用于包载递送疏水性药物，操作简单，制备步骤少，反应速度快，不需要特殊设备。就目前而言，尽管交联剂本身的用量不高，且属于环保化学试剂，但无法彻底除去是制约其广泛应用的主要原因。

图11 去溶剂法

2. 乳化法（Emulsification）

乳化法（Emulsification）的实质是将两种或者两种以上不可混溶的溶剂混在一起，乳化后分散到另一种溶剂中。乳化法制备白蛋白纳米粒是将白蛋白水溶液和药物水溶液加到含有适量乳化剂的油相或者有机溶剂中，以搅拌、超声或者高压均质等方式使其乳化，形成油包水（W/O）乳剂，再通过化学交联或者加热变形的方式使乳滴固化，最后除去残留的有机溶剂，收集白蛋白纳米粒。常用的油相多为植物油，有机溶剂多为乙酸乙酯和氯仿，而表面活性剂多用聚乙烯醇和吐温80，但这些溶剂和辅料的使用会影响白蛋白本身的生物活性。

近来，有采用水包油包水（W/O/W）复乳法制备白蛋白纳米粒，这种方法类似于多囊脂质体的制备方法。先制备W/O的初乳，在表性活性剂保护乳滴稳定的情况下将初乳分散到第二水相中，形成水包油包水的复乳。之后除去有机溶剂，白蛋白纳米粒在水溶液逐渐形成。

图12 乳化法

因为乳滴的不稳定特性，必须要表面活性剂或者是稳定剂来维持乳滴的稳定。表面活性剂和纳米粒粒径会影响药物在生理环境中的释放行为，而白蛋白的浓度、油水相比例与纳米粒粒径密切相关。

乳化法适用于疏水性药物，应用较为广泛。但是乳化过程会破坏白蛋白的稳定性，并且纳米粒的微观形态很难控制，使得该法可重复性较差，批间差异大。

3. 凝胶法（Gelation）

凝胶法（Gelation）根据处理方式的不同，可分为热凝胶法（Thermal gelation）和pH凝胶法（pH- gelation）。

热凝胶法是加热条件下使白蛋白变性聚集形成纳米粒的一种方法。对白蛋白溶液进行加热处理，心形白蛋白内的α-螺旋、β-折叠和肽链构象会逐渐展开形成凝胶，白蛋白的整个聚集过程与非共价键（如疏水性、静电作用和氢键结合，编者个人认为：氢键是键能弱于共价键但强于分子间作用力的一种范德华力）和共价键（二硫键）相关。

pH凝胶法是通过调节溶液体系的酸碱度，使白蛋白沉淀形成纳米粒。蛋白的沉淀聚集取决于分子间的二硫键，溶液的温度和酸碱度影响着二硫键的状态。一般情况，碱性条件下，带负电荷的白蛋白会互相排斥，蛋白分子结构展开，诱导二硫键引起分子聚集，形成结构更为稳定的白蛋白纳米粒。此外，白蛋白是具有多个带电官能团的两性大分子，通过调节蛋白电荷可以与其他聚合物静电作用形成复合物，成为一种具有生物相容性的复合药物递送系统，目前的研究中主要用于促进生物活性处理和基因物质的递送。

凝胶法的最大问题是无法通过调节温度和酸碱度来精准控制白蛋白纳米粒的粒径，而pH凝胶法多在高浓度白蛋白溶液中进行，普通的玻璃电极测定pH值会存在较大数据偏差。

4. 喷雾法（Spraying）

根据采用设备的不同，可将喷雾法分为纳米喷雾干燥法（Nano Spray Drying）和电喷射法（Electrospraying）。

纳米喷雾干燥法（Nano Spray Drying）是一种将白蛋白溶液直接处理成纳米粒的技术。白蛋白溶液经喷雾干燥仪的喷嘴形成喷雾进入设备内室中，加热的氮气和二氧化碳气流对喷雾进行处理后流向底部。而底部有电极专门收集纳米粒，在电极的引导下实现白蛋白纳米粒的富集。这种技术可以通过控制气流实现全程温度控制，适用于温敏药物。可以通过调整喷嘴的尺寸、气体温度、白蛋白浓度和流速来控制白蛋白纳米粒的粒径。如需改善白蛋白纳米粒，可以加入适量表面活性剂，表面活性剂会将纳米粒的形态尽可能维持球体，增加纳米粒子稳定性。与其他方法不同的是，纳米喷雾干燥法也适用于水溶性药物。

电喷射法（Electrospraying）是一种外加高电压使液体雾化的技术。具体过程是在高电压条件下，将白蛋白溶液经仪器喷嘴喷射形成雾化液滴，雾化液滴中含有胶状的白蛋白纳米粒，除去溶剂后即可固化纳米粒。电喷射法制备白蛋白纳米粒类似于电辐射制备纳米结构载体，包封率较高，纳米粒的稳定性和重现性良好，喷嘴尺寸、电压强度、流速等可控参数影响产品的质量。

图13 喷雾法

5. 自组装法（Self‑assembly）

自组装法（Self‑assembly）的实质是白蛋白溶液在超过临界胶束浓度(Critical micelle concentration, CMC)和临界共溶温度(Critical solution temperature, CMT)的情况下，会自发形成结构更为明确和稳定的纳米团聚体，即纳米粒。

自组装法常用的方法是通过加入还原剂还原白蛋白的二硫键、加入变性剂或者脂溶性药物来减少白蛋白表面的伯胺基团，增加白蛋白分子的疏水性，诱导分子间非共价相互作用形成白蛋白纳米粒，其中的疏水性区域可以包载疏水性药物分子。常用的还原剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸，

自组装法的特点是白蛋白纳米粒由纳米胶束固化而来，所以柔性好粒径小，纳米粒能穿过生理屏障，高效地将药物递送至生物组织和器官内。但该方法存在的问题是还原剂的使用，残留的还原剂存在一定的安全隐患。

图14 自组装法

6. Nab^TM技术（Nab™technology）

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