药物递送（三）——mRNA疫苗递送技术（LNP）
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2020年12月11日，美国FDA授权辉瑞和BioNTech运用mRNA技术共同研发的新冠疫苗的紧急使用许可。一方面，这是全球首个正式获批并大规模推广的新冠疫苗；另一方面，也是首个mRNA技术路线上市的疫苗。
一 概 述
1.mRNA的的定义
mRNA，即信使RNA， 信使核糖核酸，在DNA的基础上发展而来。
1953年，Watson和Crick提出了具有“创世纪”意义的DNA双螺旋结构（皮一下：刺客信条里描述上古文明中伊述人的DNA为三螺旋结构，即为我们口中北欧民族的“神”）。
1960年，Fran ois Jacob和Matthew Meselson通过噬菌体感染大肠杆菌确定了细胞内存在一种将细胞核里的遗传信息转移到细胞质的机制。于是，1961年他们提出了mRNA假说： 细胞内应该有一类充当信使的RNA分子，它们由许多不同的mRNA分子组成，每一种mRNA在核苷酸序列与DNA上的基因序列互补，然后被运输到细胞质为蛋白质合成提供模板。 在一种蛋白质合成结束以后，它的mRNA将离开核糖体，为其他的mRNAs“让路”。
1964年，Sydney Brenner利用T4噬菌体感染重同位素标记的细菌，证明了mRNA假说是正确的，也从侧面验证了中心法则（genetic central dogma）。
mRNA以细胞中基因为模板，依据碱基互补配对原则转录生成后，含有与DNA分子中某些功能片段相对应的碱基序列，即可作为蛋白质生物合成的直接模板。mRNA仅占总RNA的2%~5%，但种类繁多，代谢十分活跃，半衰期极短，甚至会在合成后数分钟内被分解。
2020年12月11 日，FDA授权一款运用mRNA技术研制的新冠疫苗的紧急使用许可，这是历史上首个mRNA技术路线上市的疫苗。
2.mRNA的优势
较强的免疫原性和不稳定性，是mRNA在前期的研究远远不如DNA多的重要原因。直到将被修饰的核苷引入到mRNA的序列中，且研发出可以包裹和递送mRNA的载体，才基本解决了递送过程中的技术难题。
其实，mRNA比DNA更具优势，并且能介导更优的转染效率和更长的蛋白表达时间。
优势有：
（1）由中心法则可知，mRNA通过体外转录合成，这个过程较为简单，并且mRNA在理论上能够表达任何蛋白，有治疗多种疾病的潜力。
（ 2 ） DNA 作为遗传学的核心，只有进入细胞核中才能转录成 mRNA 。而 mRNA 无需进入细胞核 ，在细胞质中即可启动蛋白翻译，其效率大大高于 DNA 。
（ 3 ） mRNA 不会像 DNA 和病毒载体那样插入基因组中影响遗传信息， mRNA 编码蛋白只会在瞬间表达，之后很快被降解， 不存在基因整合的风险 ，安全性高。
（ 4 ）与蛋白和病毒相比， mRNA 可以 快速在细胞内翻译所需蛋白 ，起效较快。并且生产简单，成本低廉，易于工业化生产。
3.mRNA递送的挑战
mRNA链是带有负电荷的长链大分子，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得mRNA分子较难穿过细胞膜进入细胞内。并且，因为mRNA分子是单链，本身极其脆弱，体内的多种酶都能将它迅速降解。mRNA编码信息中涵盖了核糖体生成蛋白的序列，必须递送至细胞内才能编码蛋白。所以将mRNA递送到细胞内部共有两道屏障： 递送途中的酶降解；静电排斥致使的膜屏障 。
4.mRNA疫苗的类别
自2019年新型冠状病毒感染性肺炎病毒（2019-nCoV）大肆传播以来，人类一直在为自身的健康安全研发疫苗，而mRNA疫苗是目前最热门的话题。
表一 各类疫苗的原理和特点
mRNA疫苗的核心原理是 在mRNA中编码抗原遗传信息，然后递送至宿主细胞的细胞质中，在体内表达并诱导抗原特异性免疫应答 。mRNA疫苗可以生产针对任何已知蛋白靶点的病原体，并且mRNA是利用无细胞的酶转录反应生产，保证了疫苗可以进行快速放大生产。
目前，有三种主要的 RNA 疫苗： mRNA 、 bmRNA 、 saRNA 。
mRNA 为常规的、非扩增的 mRNA 分子； bmRNA 为碱基修饰的、非扩增的 mRNA 分子； saRNA 为核苷酸化学修饰、自扩增的 mRNA 分子。
表二 mRNA的类别和特点疫苗类别
saRNA又名复制子，能实现自扩增。 相比于非自扩增的RNA，自扩增RNA的最大优势是自我复制，仅需较低剂量的RNA，便可实现无细胞参与的快速扩增。 这对于大规模生产来说，可显著降低成本，能在短时间内应用于临床。
表三 COVID-19 mRNA疫苗类型研发企业
二 递送技术
mRNA分子量大，亲水性强，生物活性是小分子药物的上千倍，工业生产比较容易。但自身的单链结构致使其极为 不稳定，易被降解，自身携带负电荷 ，穿过表面同为负电荷的细胞膜递送亦是难题。
所以需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达，改变mRNA胞内的生物分布、细胞靶向和摄取机制，促进mRNA的递送，发挥疫苗的效果。
目前常用的递送技术有电穿孔（Electroporation）、鱼精蛋白(Protamine)、阳离子纳米乳液(Cationic nanoemulsion)、阳离子聚合物脂质体(Cationicpolymer liposome)等。电穿孔是将mRNA分子通过高压脉冲形成的膜空隙，直接进入人体细胞发生的转染。其余方法都是保护mRNA分子胞外降解，或者促进mRNA分子与细胞膜融合提高转染。
随着两款mRNA疫苗被批准用于接种预防新冠病毒，LNP无疑是目前最热门的递送技术。
表四 部分在研或上市LNP技术的mRNA疫苗
1.mRNA/LNP的组成和结构
准确说来，载mRNA的脂质纳米粒（Lipid nanoparticle,LNP）除了含有带负电荷的mRNA外，另有四种成分： 可电离的阳离子磷脂（ionizable lipids），中性辅助磷脂，胆固醇，聚乙二醇修饰的磷脂（PEGylated lipid） 。
表五 LNP各组分的比例组分
脂质纳米粒中辅料的作用与该类辅料在脂质体中的作用类似： 中性辅助磷脂 一般为饱和磷脂，可提高阳离子脂质体的相变温度， 支持层状脂质双层结构的形成并稳定其结构排列 ； 胆固醇有较强的膜融合性 ，促进mRNA胞内摄入和胞质进入； PEG化磷脂位于脂质纳米粒表面，改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，防止颗粒聚集 ， 增加稳定性 。最关键的辅料是可电离阳离子磷脂，它是mRNA递送和转染效率的决定性因素。
2.mRNA/LNP的递送
（1）可电离阳离子磷脂
可电离阳离子磷脂是决定mRNA递送和转染效率的关键因素，该阳离子磷脂需要在生理条件下（pH=7.4）不电离，而在酸性条件下（≤5.0）发生电离。目前已有多种可电离的阳离子磷脂被开发。
由化学结构可知，可电离阳离子磷脂至少含有一个叔胺，有的还含有一个或多个仲胺，且有能发生水解反应的羧酸酯（除C12-200外）。在酸性环境下，叔胺质子化，磷脂形成一个较小的两性离子头部和一个疏水链尾部，形成一个锥形结构，促进膜向六方晶相转变从而实现高效递送和转染。
羧酸酯的存在保证磷脂在体内的可降解性，避免磷脂的蓄积引起毒副作用。利用2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸（TNS）检测磷脂的实际酸度系数（pKa），在6~7范围内。可电离阳离子磷脂的极性属于pH响应型，在酸性环境中，携带正电荷，可与mRNA静电络合形成复合体，稳定mRNA分子。在中性生理条件pH值下，属中性，减少其毒副作用。
（ 2 ） mRNA/LNP 的递送原理
入胞前，阳离子脂质可实现与带负电荷的mRNA分子静电络合，形成复合体，提高mRNA分子的稳定性。
mRNA/LNP到达细胞膜时，阳离子磷脂与带负电荷的细胞膜触发膜融合，细胞膜去稳定化，促进mRNA分子的递送。
内化进入细胞后，随着含有多种水解酶的溶酶体分解外源和外源大分子，pH值降低形成偏酸环境，使可离子化的脂质质子化，LNP的双层结构遭受破坏，释放mRNA，按照“中心法则”与负责生产蛋白的核糖体结合，翻译成病毒蛋白，即抗体，中和病毒。
（3）mRNA/LNP的炎症和基因编辑疗法
科学家在对小鼠进行LNP皮内给药后发现，存在大量的中性粒细胞浸润，多种炎症途径的激活以及各种炎症细胞因子和趋化因子的产生。鼻内给药时，也观察到类似情况。Pfizer/BioNTech或Moderna疫苗肌肉接种后，在小鼠皮内接种后导致促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白-1α和巨噬细胞炎性蛋白-1β的分泌。
研究人员发现LNP的炎症特性并不是特定部位的，他们猜测这可能是SARS-CoV-2疫苗的副作用，归因于其强大的辅助活性及其优越性，LNP的高效率递送引起较强的保护性免疫反应，确切机制还需要进一步的研究来确定。
目前对LNP递送的机制研究主要集中在保护mRNA和提高转染方面，但由2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna博士联合创建的Intellia Therapeutics公司近日宣布，他们将Cas9mRNA和single-guide RNA (sgRNA)通过NanoAssemblr成功包载在由阳离子磷脂等多种磷脂组成的LNP中。
制备的CRISPR LNPs (cLNPs)能够特异性地将CRISPR基因编辑疗法递送到骨髓中，从而增强对造血干细胞和骨髓细胞的基因编辑。对于开发治疗像镰刀型细胞贫血病（SCD）等遗传性血液疾病的疗法来说，这一突破有望克服与体外基因编辑相关的操作复杂性和安全性。
（ 4 ）新冠疫苗存在的争议隐患
2021年5月25日，《Cell》杂志报道了日本学者的一篇论文（An infectivity-enhancing site on the SARS-CoV-2spike protein targeted by antibodies），论文阐述了感染新冠病毒的患者可能出现抗体增强，存在潜在的ADE效应。
何为ADE效应？ADE（Antibody-DependentEnhancement），即为抗体依赖增强。
我们都知道病毒感染是从接触和黏附开始的。病毒表面蛋白与靶细胞上特异性受体和配体分子黏附后相互作用，发生病毒感染。而疫苗策略就是开发针对病毒表面蛋白的特异性抗体，中和病毒，使其失去感染能力。然而有的时候抗体在抑制病毒感染过程中却是发挥了相反的作用，它们协助病毒进入细胞，提高病毒感染率，该现象即为抗体依赖性增强作用。
科学家之所以对ADE效应表示担忧，是因为曾在猫感染性腹膜炎冠状病毒（FIPV）感染过程和抗登革热病毒蛋白的抗体中发现了该现象。当时发现Fc受体（对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体）介导诱发了ADE，证明了增强冠状病毒感染抗体的存在。对ADE效应发生的确切机制尚需继续探索，且目前并未在感染病例和接种疫苗后感染病例中发现ADE，但科学界对这种效应的担忧仍是有道理的。
3.其他递送技术
目前最常用的mRNA疫苗递送手段除了脂质纳米粒（Lipidnanoparticle，LNP），还有阳离子脂质复合物(lipoplex，LPX)、脂质多聚复合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物纳米颗粒（Polymer nanoparticles，PNP）、无机纳米颗粒（Inorganic nanoparticles，INP）阳离子纳米乳(Cationic nanoemulsion，CNE)等。
（1）聚合物纳米粒（PNP）
聚合物纳米粒因易于合成，成为mRNA递送的载体。选用的聚合物体内降解而不会产生有毒成分。聚合物纳米粒可以与核酸mRNA结合，在生理pH下形成多聚复合物，以促进基因递送。通常情况下，聚合物纳米粒带正电荷，以促进与mRNA的静电络合。通过使用可降解的连接物，也可实现mRNA与聚合物的共价连接。
（2）脂质多聚复合物（LPP）
脂质多聚复合物是我国斯微生物拥有自主知识产权的递送技术。该技术是一种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构。相比传统LNP具有更好的包载、保护mRNA的效果，并能够随聚合物的降解逐步释放mRNA分子。LPP平台优异的树突状细胞靶向性可以更好地通过抗原递呈激活T细胞的免疫反应，从而达到理想的免疫治疗效果。
（3）无机纳米粒（INP）
无机纳米粒由无机颗粒和可生物降解的聚阳离子合成，例如金属磁性纳米颗粒。最常见的是介孔硅纳米粒，介孔硅纳米粒具有孔道均匀、易于官能化、生物相容性、高比表面积、大孔容和可生物降解性等特性。为提高对mRNA的递送和转染效率，通常在其表面或者孔道内包裹阳离子聚合物。
（ 4 ） GalNac 技术
GalNac是N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine）的缩写，国内的瑞博生物有自主研发的GalNac递送技术平台。该平台是基于GalNAc与小核酸共价连接，GalNac可以与实质肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性结合，实现细胞的快速胞吞。该技术具有高度的肝靶向特异性，给药后高效富集到肝组织，进入其他组织的量非常少。
最早采用ESC-GalNac递送技术的是美国Alnylam公司，这是一种靶向修饰技术，其产品Lumasiran是一种皮下注射的治疗原发性1型高草酸尿症（PH1）的RNAi药物，已在欧洲获批上市。
三 制备技术
1.生产流程
根据纽约时报公开的信息，疫苗的整个生产流程从质粒的提取繁殖到最终的疫苗，一共可分为如下几步：
Step 1：将含有病毒的核酸序列的质粒，注入到大肠杆菌中，这里的质粒可以是从病毒中提取，但更安全有效的方法是根据发表的核酸序列优化设计直接连接到质粒上，避免跟病毒直接接触；
Step 2：在温暖适宜的条件下，大量繁殖生长携带了质粒的大肠杆菌；
Step 3：将上述生长繁殖的大肠杆菌转移至体积更大的营养液里，适宜条件下存放发酵，使其复制亿万级别的质粒；
Step 4：发酵结束后，加入酶或者其他化学物质分解大肠杆菌细胞壁，收集并纯化质粒；
Step 5：检测上述的质粒，确保质粒携带的基因序列未发生变异，能够用于后续的疫苗生产；
Step 6：加入限制性核酸内切酶，从环状的质粒中切割出直线段的病毒基因，并除去残留的细菌和质粒片段；
Step 7：根据“中心法则”，以DNA为模板转录成mRNA；mRNA进入人体，其携带的病毒基因即可在体内翻译出病毒蛋白，即为抗体，用于中和病毒；mRNA也需进行质量中控，确保能用于后续的疫苗生产；
Step 8：准备脂质，用于保护mRNA进入体内时不会被破坏；
Step 9：精确的控制着mRNA和脂质流速，将他们混合成脂质纳米粒。
2.mRNA/LNP 的制备
mRNA/LNP传统的制备方法是 两相混合再经均质技术 （高压均质机、高压微射流）或者挤出技术（聚碳酸酯膜过滤器）控制粒径。该法制备的纳米粒形成多层结构，mRNA分子夹在同心脂质双层。该方法包封率普遍不高，并且需要高精度高专业化的设备，导致工艺放大困难。
另一种方法是 乙醇稀释法 。将各种脂质溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水缓冲液中，将两相快速混合。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒，同时高效包载mRNA。再经缓冲液膜包超滤除去残留的乙醇，中和缓冲液的pH值。
目前，商业化生产大批mRNA/LNP利用微流体或T型接头混合，作为新型的微流体设备，该制备方法快速简便，对于疫苗这类小剂量药物具有明显优势。
表七 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗
对于mRNA/LNP的形成机制，有学者提出，两相在酸性pH条件下快速混合，会形成“中空”结构的小粒径脂质体和与“非中空”的电子致密大粒径颗粒。膜包超滤过程中，随着pH的中和，颗粒发生融合，最终形成mRNA/LNP系统。
写在最后
尽管均为mRNA疫苗，但 BioNTech和Moderna的mRNA疫苗存在差异：
表八 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗差异对比
除了BioNTech和Moderna的mRNA疫苗，其他公司也在研发或者已经上市类似产品。国内上市的都是传统灭活病毒疫苗，mRNA疫苗仍处于临床研究阶段，目前研发进度最靠前的是艾博生物，5月已进入III期临床阶段。
2021年5月10日，上海复星医药（集团）股份有限公司在上交所发布公告称，控股子公司复星医药产业拟与德国拜恩泰科（BioNTech）投资设立合资公司，以实现mRNA新冠疫苗产品的本地化生产及商业化。
表九 国内mRNA疫苗在研情况
2021年5月5日，美国表示为了尽快普及安全有效的疫苗，结束新冠肺炎疫情，美国将放弃新冠肺炎疫苗的知识产权专利。但知识产权是全球新冠肺炎疫苗短缺问题的一部分，但更大的问题在于制造业。另外，从上面两张“公关人员飞行图”和“销售人员飞行图”可知，mRNA疫苗的专利错综复杂，并非全系美国。
宾夕法尼亚大学的Katalin Karikó和Drew Weissman教授作为mRNA技术的奠基者，拥有编码mRNA的核心专利，该核心专利几经转让，最终到了Moderna和BioNTech手中。
2019年，在美国著名病毒专家福奇带领下，依托强大的研发能力及数据积累优势，构建了新冠病毒棘突蛋白，并申请了专利，已上市的BNT162b2和mRNA-1273均应用该相关专利。
mRNA体内递送载体LNP方面，由加拿大的不列颠哥伦比亚大学和Arbutus公司于1998年共同完成，后辗转授权给了Moderna和BioNTech。
目前上市的疫苗并非终身免疫，新冠将逐渐常态化，新冠疫苗依旧是一块甜美的“蛋糕”。
而作为mRNA高效载体的LNP，它的作用绝非只能用于基因递送或者大分子药物，相信随着相关技术越发成熟，LNP技术信息透明的时候或许就是它运用于其他药物递送的时候。
登山不以艰险而止，则必臻乎峻岭矣！
END
参考文献：
A network analysisof COVID-19 mRNA vaccine patents
Rosenblum et al.,Sci.Adv. 2020; 6 : eabc9450
The mRNA-LNP platform’s lipid nanoparticlecomponent used in preclinical vaccine studies is highly inflammatory
A.K.Blakney, S.Ip, A.J.Geall, An Update onSelf-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vacciens, 2021, 9, 97.
Exploring the Supply Chain of thePfizer/BioNTech and Moderna COVID-19 vaccines
Yuhua Weng, Chunhui Li, Tongren Yang,et，al.The challenge andprospect of mRNA therapeutics landscape.Biotechnology Advances.Volume 40,May–June 2020, 107534
