人外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）即外周血中具有单个核的细胞。包括淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞又包括NK细胞，T细胞以及B细胞等，而红细胞和血小板为无核细胞，中性粒细胞，嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞为多核细胞。PBMC是免疫学领域，感染性疾病领域，恶性血液疾病，疫苗开发以及移植免疫等领域学者经常需要的研究原材料。

【操作步骤】

所需试剂：

1 IMDM，α-MEM或RPMI-1640

2 FBS

3 DNase I

操作流程：

1准备好37°C水浴，将RPMI-1640与FBS温浴至37°C；

2生物安全柜中，配制含10%FBS的培养基（IMDM, α-MEM或RPMI-1640均可），待用；

3从液氮中取出PBMC冻存管，置于-80°C超低温冰箱中数分钟，使冻存管中的液氮挥发，而后迅速将其置于37°C温水中，并快速水平晃动，使其内含物尽快融化，直至冻存管固体内含物余下一小冰屑后取出冻存管；

注意：

1）从液氮中取出冻存管时，往往在冻存管里含有液氮，最好先将冻存管先置于超低温冰箱中，使液氮挥发，再进行水浴化冻的操作；

2）尽可能将冻存管的内含物全部浸没于37°C温水中，使内含物均匀融化；

3) 请勿使温水没过冻存管盖的螺口，以防污染；

4) 细胞复苏的操作过程要迅速，避免影响细胞复苏后的活性。

4在将冻存管拿进生物安全柜之前，用75%酒精对其表面进行消毒；

5轻轻重悬细胞，并将其移入装有300μg DNase I的50mL离心管里；

注意：

1）加入DNase I可有效减少PBMC复苏后细胞团块的产生；

2）DNase I的使用是非必须的，对于DNA, RNA等的提取目的可不使用。

6用1mL培养基冲洗冻存管，并将此悬液以3-5s每滴的速度滴加到50mL离心管中，并且同时

轻轻摇晃离心管，使滴加的悬液混匀；

7吸取15-20mL的培养基以3-5s每滴的速度滴加到50mL离心管中，并且同时轻轻摇晃离心管，

使滴加的悬液混匀；

注意：第5,6,7步骤可使PBMC中的DMSO缓慢均匀的渗透出来，最大程度保证细胞安全，但操作较为缓慢，若有多个样品需要处理时，可以将操作步骤更改为：

 5’：轻轻重悬细胞，并将其移入装有300μg DNase I的15mL离心管里；

 6’：用1mL培养基冲洗冻存管，并将此悬液合并到到15mL离心管里；

 7’：吸取10mL培养基，直接加入到15mL离心管中，反复轻柔吹打或上下颠倒混匀，室温孵育10min；

8室温下，300g离心10min；

9迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使PBMC悬浮；

注意：

1）离心结束后，尽快吸走上清；

2) 吹打液体时动作要轻，避免损伤PBMC，并且吹打时尽可能避免气泡产生。

10缓慢加入15-20mL新鲜培养基，并同时轻轻摇晃离心管；

11室温下，300g离心10min；

12迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使PBMC悬浮，此PBMC

即可用于下游实验。