小分子多肽（4KD）Western blot经验交流

一、目的蛋白

1. 一种多肽（4KD左右）

二、所用试剂

1. 上样缓冲液：SDS-PAGE loading buffer，4x（with DTT）；公司：Solarbio
2. marker：Prestained Protein Ladder；公司：Thermo Scientific
3. 凝胶制备试剂：SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒；公司：Solarbio
4. BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液；公司：Beyotime

三、试剂配置

1. 电泳缓冲液（2L）：Tris：6.06g + 甘氨酸：28.8g + SDS：2g → 溶于2L去离子水
2. 转膜液（2L）：Tris：6.06g + 甘氨酸：28.8g →溶解于1600ml去离子水 → 加400 ml甲醇

四、实验流程

1. 制胶：15%分离胶，5%浓缩胶（按照SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒说明书去配置）
2. 点样：如图1所示
3. 电泳：置于冰水上电泳；浓缩胶（80v，55min）；分离胶（120v，47min）
4. 转膜：220mA，30min（此处转膜是取右半部分去转膜，主要目的是想看看这个条件能不能把小分子转过去，然后转完膜，用PVDF膜来做考马斯亮蓝染色验证）
5. 考马斯亮蓝染色：用电泳完左半部分的胶来做考马斯亮蓝染色（染色之前用去离子水洗涤3min，减少残留的SDS所增加染色背景，然后直接加考马斯亮蓝超快染色液，放在摇床上染色过夜）

图1: 电泳上样

五、实验结果

图2：电泳以及转膜和转膜后的凝胶

图3: 电泳完的凝胶做考马斯亮蓝染色的结果（分别为灰色和蓝色背景）

图4：转完膜，PVDF膜考马斯亮蓝染色的结果

六、实验分析与思考

1. 虽然我老师说这个多肽只有4KD大小，但是加的正对照就只含有目的多肽，而且随着目的多肽稀释倍数的增加，黑色团块也慢慢变淡，由此可以确定对照泳道下面10KD附近的一团黑色就是目的多肽。
2. 对照电泳成黑色的团块，是因为小分子多肽弥散导致的吗？上一次看到这个结果，首先怀疑是电泳时间过长导致的（上一次跑电泳的条件：分离胶的电泳时间是120v，125min，结果如图5所示），但是结果和这一次电泳（分离胶120v，47min）的结果感觉差别不大，都很弥散，所以我在考虑，这个小分子多肽的弥散跟电泳时间没有多大的关系，主要是这种传统胶无法避免的？（但是实验室的师兄有用过传统的10%分离胶跑出过4KD的小分子蛋白）。
3. 怎样改进条件才能跑出一条完整的目的条带（就是怎么减少小分子多肽在电泳时候的弥散）？我看到网上说小分子蛋白要用trince胶来跑，但是这个还没有深入了解过，主要是实验室的师兄之前有用过普通的胶也跑出过小分子蛋白，所以目前暂时不考虑换其他胶，想继续改进一下条件试一下。
4. 我的marker最小标记条带是10KD（绿色的），但是marker颜色的大小会和蛋白实际的大小会有出入吗？因为我感觉对照的位置还是偏上了一些。
5. 最后一点，也是很疑惑的一点，就是我电泳完的胶，用考马斯亮蓝染色，为什么总是看到一条不是很明显得线（就是泳道不分明，连成了一条线），如图3所示，对照的泳道在大分子位置处也出现了很多一条条黑线，和其他样本连在一起（正常对照只含有一种蛋白，不会出现这么多条带），所以我就非常疑惑，这是什么原因导致的？

图5：上一次电泳（分离胶120v，125min）凝胶考马染色结果

以上就是我的一些实验过程、实验结果，以及一些困扰的问题

希望有跑过小分子蛋白的朋友给点建议啊，非常非常非常感谢！！！！！！！！！