什么！！！Western blot怎么那么多内参？你选对了吗
1 什么是蛋白/基因内参
蛋白是基因翻译而来，在次，我们可以简单地理解为“基因就是蛋白，蛋白就是基因”（不想杠哈，也不要杠哈，我知道这样描述是不太正确的）。而不同的基因可能会在动物个体/细胞存在时空表达差异，因此，在进行western blot 或者qRT-PCR实验室选择合适的“管家蛋白/基因”去归一化蛋白和基因的表达至关重要。
管家基因（housekeeping gene）的概念已经使用了四十年，但仍然定义松散。管家基因通常被描述为“无论它们在组织或生物体中的特定功能如何，它们都对细胞存在至关重要”，并且“无论组织类型、发育阶段、细胞周期状态或外部信号如何，都能稳定表达” [1]。
管家基因通常与四个主要的生物学标准相关——样本中表达的稳定性、必要性、参与细胞维持和进化保守 [1]。
（图1探索管家基因的四个属性之间的关系）
然而，表达稳定性通常在少数细胞类型和条件下进行测试，然后推断在大多数细胞类型和条件下是稳定的，是不够严谨和科学。此外，表达稳定性（在细胞类型和条件下的相似表达）、功能（例如，属于细胞维持）、本质性（功能丧失是致命的）和保守性（在这种情况下，在分类群中稳定表达和必不可少）是基因的四个截然不同的特性，去推断管家基因/蛋白也是不够严谨和科学。
2 如何选择合适的管家蛋白/基因
蛋白质印迹（western blot）可读取蛋白质表达水平的差异，例如特定时间段内蛋白质水平的变化、基因敲除型细胞系与野生型细胞系的差异以及患者样本中表达的改变。然而，要从蛋白质印迹中得出结论，您需要确保观察到的差异仅归因于蛋白质表达水平的改变，而不是凝胶上样或蛋白质转移错误，这就是蛋白质印迹上样管家蛋白可以提供帮助的地方。目前针对不同的组织/细胞已经对管家蛋白进行了比较好的修正和提出了比较合适管家蛋白。
表1 不同细胞结构选择不同的管家/对照蛋白[2]
表2 不用细胞结构可选择的内参蛋白[3]
表3 不用细胞结构可选择的内参蛋白 [4]
3 管家蛋白注释
3.1 全细胞蛋白管家蛋白
激动蛋白家族：α-actin、 α1 –actin、β-actin、 γ1-actin 、γ2-actin，肌动蛋白是高度保守的。α-actin、β-actin在western blot中经常被用作管家/对照蛋白。
β-actin，即肌动蛋白，广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但也有特殊情况，比方脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。
GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）全称是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，它存在于胞浆、细胞核、核周区及膜上，GAPDH在western blot和qRT-PCR中经常被用作管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。GAPDH在物种间是高度保守，研究表明相对于年龄和性别而言却是保持恒定的，但是GAPDH mRNA表达水平在不同组织类型中有显著差异。
微管蛋白（Tubulin）家族：微管蛋白分为5种：α, β, γ, δ，ε- Tubulin，其中α- Tubulin和β-Tubulin经常被用作全细胞蛋白归一化的管家/对照蛋白，在神经系统和生殖系统的全细胞蛋白归一化用得比较多。经常被用作全细胞管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
Vinculin 是一种细胞质肌动蛋白结合蛋白，富含黏着斑和粘附连接，对胚胎发育至关重要，经常被用作全细胞管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
cyclophilin B (CypB)：是一种肽基-脯氨酰顺式-反式异构酶，广泛存在于人体组织中，可催化脯氨酸-亚胺肽键的异构化以调节蛋白质折叠，经常被用作全细胞管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
Cofilin：氨基酸序列和结构从人类到酵母都是高度保守的，所有真核细胞中至少存在一种丝切蛋白，经常被用作全细胞管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
3.2 细胞核蛋白管家蛋白
TATA-box binding protein （TBP）：TBP的C端核心结构域的具有很强的保守性，TBP家族的转录调控及其与启动子DNA的相互作用，经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
组蛋白家族：对于染色质基本结构“核小体”的主要组成蛋白，包含H1,H2A,H2B,H3,H4,其中四个核心组蛋白（H2A,H2B,H3,H4）相对较小（11-15 kDa），是真核生物中高度保守的非常基本的蛋白质，经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)：PCNA形成一个环绕DNA双螺旋的三聚体环，并在复制叉处充当DNA合成机制的支架蛋白，PCNA对于细胞增殖和存活是必不可少的，且在不同物种之间是保守的。经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
deacetylases (HDACs)：人类和啮齿动物基因组编码 11 种 HDAC 蛋白，HDAC1 和 HDAC2，在小鼠中显示出 87% 的氨基酸序列同一性，并且这些蛋白质在各种组织和细胞类型中共表达，经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
Yin Yang1（YY1）：是一种普遍表达的转录因子，可调节多种生物过程，在细胞分化和组织发育中具有突出作用，经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
Lamin B1 (LmnB1)：是间期核中适当凝聚染色体所必需的，在染色体区域的浓缩、异染色质的分布以及基因表达和剪接的调节中起着核心作用，在真核生物具有保守性，经常被用作细胞核管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
3.3 线粒体蛋白管家蛋白
voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1)：在线粒体外膜上运输离子和小分子，是一种存在于植物、真菌和哺乳动物中的线粒体外膜，经常被用作线粒体管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
HSP60：热休克蛋白 （HSP） 是由细胞应激诱导的无处不在且进化保守的蛋白质。特别是 HSP60是一种典型的线粒体分子伴侣，经常被用作线粒体管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
细胞色素 c 氧化酶家族：cytochrome c oxidases (CcO)，存在于所有线粒体中以及几种需氧细菌， COX IV是呼吸链的最后一个电子受体，参与 O 的还原2至 H2O。COX组装具有保守和特定的特征，这可能是由于在进化过程中掺入了一组不同的亚基，经常被用作线粒体管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
SDHA（Succinate Dehydrogenase Complex Flavoprotein Subunit A）：该基因编码琥珀酸-泛醌氧化还原酶的主要催化亚基，这是线粒体呼吸链的复合体。该复合体由四个核编码亚基组成，定位于线粒体内膜。经常被用作线粒体管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
3.4 细胞膜蛋白管家蛋白
NaK ATPase：钠钾腺苷三磷酸酶是一种电生跨膜酶，位于所有动物细胞的质膜中，催化钠离子和钾离子进入细胞的主动转运，经常被用作细胞膜管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
3.5 血清蛋白管家蛋白
Transferrin：它被认为是由古代基因复制事件产生的结果，该蛋白的功能是将铁从肠道、网状内皮系统和肝实质细胞转运到体内所有增殖细胞。所有脊椎动物都具有功能性Tf或卵转铁蛋白，在爬行动物和鸟类中具有铁结合和抗菌特性。经常被用作血清管家蛋白/基因用于归一化目标蛋白/基因。
4 蛋白调齐
在根据获得的样品组织选择合适的内参蛋白，就可以提取相关蛋白，对蛋白进行western blot 定量实验。
4.1 常规调齐方式
使用 BCA法，一般情况下技术重复越多，也容易调平，那么针对普通的调齐需要注意：（1）不少于3个重复；（2）保证加样时间不能差距太大；（3）注意防止待测孔的污染。
4.2 难以调平的蛋白
估计尝试了BCA法了，那么你是否注意一下几点了呢？（1）重复不少于6；（2）尽量使用进口移液器加样；（3）在液体反应期间避光；（4）封闭well的口；（5）液滴全部滴加至well的底部，保证反应的物质是一样；
那么BCA改进了依然无法调平怎么办？接着用western blot直接进行内参的调平，（1）必保证蛋白上游体积一样；（2）尽量将样品原理SDS-PAGE的边缘的泳道；（3）灰度值计算时候，在使用相关软件时候，务必正确统计灰度值，比如方法一致，圈住的印迹应该是蛋白的真实印迹；（4）换仪器或试剂进行western blot，然后根据灰度值调节蛋白浓度。
4.3 western blot调平过程中常见问题
这里就不在赘述了，估计也应该是新手才会有这些问题。大家可以参考GBhouse于2024年01月30日发表的推文《Western blot你可能遇到的问题及对应解决方案》希望对大家有帮助。
如果还有问题，后台留言或私信。
（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“戈尔布乔夫：我们每天都在无耻的说别人的坏话，不要脸的说自己的好话，还不准别人说真话。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论+欢迎有偿投稿，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！将会持续一段时间对不同组织源的原代细胞分离与细胞系建立的推文，感兴趣的朋友欢迎关注）
参考
[1] Joshi CJ, Ke W, Drangowska-Way A, O'Rourke EJ, Lewis NE. What are housekeeping genes? PLoS Comput Biol. 2022 Jul 13;18(7):e1010295. doi: 10.1371/journal.pcbi.1010295. PMID: 35830477; PMCID: PMC9312424.
[2]https://www.abcam.com/primary-antibodies/loading-control-guide
[3] https://www.cellsignal.com/applications/western-blot-immunoblot/loading-control-antibodies
