求助，WB显影杂带较多

出现非特异条带的原因是什么呢？提取细胞蛋白前，用PBS润洗过2-3遍，提取2-3ul上清液在仪器上测蛋白浓度在20ug/ul左右。上样量10ul，曝光120s，颜色都较淡，在软件中调整就成这样了。一抗浓度1：1000 ，4°C过夜，说明书指示可以在1：1000~10000，二抗1：2000，室温2h，用抗体稀释液配置。封闭2h使用无蛋白封闭液。每次洗膜用TBST在摇床洗3*15min。