【求助】目的蛋白条带异常+非特异条带
发布于 2021-01-08 · 浏览 1274 · IP 重庆重庆
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请教各位，如下图所示，RUNX2是我的目的蛋白，β-actin作为内参，二者在同一张膜上，先后进行检测。在显影RUNX2时，出现两个情况：
- 多数泳道的RUNX2条带形态十分异常（以前未遇到这种情况）；
- 在100 kDa及40~50 kDa左右出现非特异条带。
内参条带虽然不齐，但形态比较正常。
我将这次的WB操作步骤简述如下：
- 准备蛋白样品：BCA测浓度后，15 μg总蛋白+5X loading buffer+ddH2O，振荡混匀，离心，95℃ 5 min使蛋白变性，上样；
- 电泳：浓缩胶80 V，30 min；10%分离胶120 V，60 min；
- 转膜：切胶，裁膜，甲醇激活，转膜液中浸泡。三明治结构：海绵-厚滤纸1层-薄滤纸1层-胶-0.45 μm PVDF膜-对称放置滤纸海绵。冰上，200 mA 90 min湿转；
- 封闭：5% BSA室温封闭1 h，TBST洗3次，5 min/次；
- 孵育RUNX2一抗：CST公司 RUNX2 (D1H7) Rabbit mAb 1:500稀释，4℃过夜；
- 回收一抗，TBST洗3次，10 min/次；
- 孵育mouse anti-Rabbit 二抗，室温1 h，TBST洗3次，5 min/次；
- ECL显影，曝光时间5 s；
- TBST洗3次，5 min/次，孵育β-actin，显影（曝光时间 2 s）。
恳请各位指点目的蛋白条带异常及出现非特异条带的原因，多谢！
最后编辑于 2021-01-08 · 浏览 1274
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