【资源总结】PCR体系引物设计和优化总结

内容较多，建议收藏！PDF可分享。

一、PCR反应体系：

一个常规PCR反应体系一般选用25～50 µ1体积，其中含有：

实际上，常规PCR体系通常使用lXPCR缓冲溶液，其中含有： 50mmol/L KCl（对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的）、lOmmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)、1.5mmol/L MgCl2 、lOOµg/ml明胶。 在购买商品化的Taq DNA聚合酶时，一般均带有lOXPCR缓冲溶液储存液， 在设置PCR反应时，按lXPCR缓冲溶液的终浓度进行稀释。需要提醒的是MgCl2 , 有些公司提供的PCR缓冲液中已经含有适当浓度的MgCl2，此时无需在常规的PCR体系中另外添加；但是有些公司的PCR缓冲液中不含有Mg2+ 而是提供独立包装的MgCl2,以便使用者在设置PCR反应体系时，能够按照个性的实验设计要求来添加。

二、引物设计：

引物有两方面的作用：按照碱基互补原则，与模板DNA的特定部位杂交，决定了扩增目的片段的特异性；两条引物结合位点之间的距离决定最后扩增产物的长度。 由于PCR扩增产物的大小由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。

(1)引物合成的质量：

PCR所用的引物必须是高质量的引物且需要纯化。 通常可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 离子交换法、 高效液相层析法(HPLC)或寡聚核苷酸纯化柱法纯化，以减少发生非特异性扩增和信号强度的降低。 使用自动DNA合成仪合成的寡聚核昔酸引物通常可以直接用于标准PCR而不需要纯化。 冻干引物可以在常温下运输。 一般冻干引物于-20℃可以保存12～24个月，甚至更长，液体状态于-20 °C可以保存6个月或更长。

(2)引物的设计原则：

不同的PCR反应体系，由于模板的组成 、 待扩增片段的长度及其使用目的不同，对引物的要求也不相同。 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能地抑制非特异扩增。 引物设计必须遵循以下原则：

1)引物长度适宜：

特异性一般通过引物的长度和退火温度控制。寡核苷酸引物的长度应适宜，一般为20～30bp , 一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。引物太短会降低退火温度影响引物与模板配对，就可能同非靶序列退火，降低反应特异性而得到不需要的扩增产物；寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好。然而，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性，而且引物过长，难以合成，还会造成浪费。

2) G+C含量合理：

引物中G+C含扯一般为40%～60%。 成对引物间的G+C含量和引物Tm值应该协调，以致它们在相近的温度下与其互补序列结合。 Tm值是寡核昔酸的解链温度，即在一定条件下，50%寡核苷酸双链解开的温度。 对于短的寡核苷酸(<25bp), 可按公式Tm=4（G+C) +2 （A+T), 可估计引物的Tm值。 如含有50%GC的20个碱基长度的寡核苷酸链的值大约在56～62℃范围内。

3)碱基随机分布：

引物中4种碱基应随机分布， 减少引物－引物同源互补的机会。 避免多个嘌呤或多个嘧啶连续出现，尤其在3'端不应存在连续3个G或C。

4）引物的位置：

通常的PCR反应需要一对引物，分别与DNA两条链两端的序列互补，其中一个为正向引物(Forward primer), 另一个为反向引物(Reverse primer)。用于基因组DNA的引物序列应位于基因组DNA的保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组DNA的非特异结合，提高反应的特异性。

若以互补DNA(complementary DNA,cDNA)为模板，则首先应尽力使引物和产物保持在信使RNA(mRNA)的编码区域内，因为这是合成蛋白质的独特序列；其次，尽量将引物放到不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从杂DNA中产生的产物在大小上相区别。

5)引物自身互补：

引物自身不应存在互补， 否则引物自身会折叠成发夹结构， 这种二级结构会严重影响引物与模板的退火结合。尤其是3'端不应存在互补序列，如果形成发卡结构， 就有可能导致PCR扩增的失败。一般引物自身连续互补的碱基不能超过3bp。

6)引物之间互补：

作为PCR反应的一对引物， 两引物之间也不应有互补性， 尤其是避免3'端的互补而形成引物二聚体。引物二聚体也是PCR反应的底物， 与靶序列竞争DNA聚合酶、 dNTP, 从而使靶序列的扩增量下降。 因此，两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

7)引物3'端修饰：

因为引物的延伸从3'端开始的， 所以3'端不能进行修饰。 一般3'端也不能发生错配，应尽量使3'端的碱基为G或C, 因为G-C互补的稳定性高千A-T互补，可以降低3'端错配的概率。

8)引物5端修饰：

引物5'端并无严格的限制， 对扩增特异性影响不大， 它决定着PCR产物 的长度，只要与模板DNA结合的引物长度足够长，5'端碱基可以不与模板DNA配对而呈游离状态。 这样就可在引物设计时在5'端加上一些限制性内切核酸酶切位点、 核糖体结合位点、 起始密码子、 突变位点，以及标记生物素、荧光素等。 但是要注意加酶切位点时应在其5'端加上1~2个保护碱基。

9)引物3'端密码子简并性：

若扩增的DNA序列位于基因编码区域， 引物的3'端应选用简并程度较低的密码子，3'端尽量不存在简并性， 否则可能会影响扩增的特异性和效率。

10)引物特异性：

引物不应与模板结合位点以外的序列互补，否则会降低反应的特异性。

(3)引物的浓度：

PCR反应体系中每条引物的终浓度一般为 0.1～1.0μmol/L, 以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度过低则会降低产量，过高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

(4)利用引物设计软件：

现在商品化的专业引物设计软件， 具有强大的应用功能， 这些程序既方便又实用可以帮助我们进行引物设计。如普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质性等。 需要强调的是，虽然引物设计软件使引物设计智能化，但是设计原则还是一样的，而且即使最好的程序也并非是完美无缺。

三、PCR体系优化：

1、Mg2+浓度：

Mg2+作用是激活DNA聚合酶，且优于Mn2+，而Ca2+则无效。由于dNTP于寡核苷酸结合Mg2+，因而反应体系中的阳离子的摩尔浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。通常PCR的缓冲液中应用Mg2+的最佳浓度相当低（1.5mmol/L），但有报道，增加Mg2+的浓度至4.5mmol/L或6.0mmol/L可减少非特异性引导，因此，Mg2+的最佳浓度必须结合不同的引物与模板用经验方法通过预实验予以确定。

在正式实验前，首先配制好除Mg2+外的PCR反应体系： 固定的DNA模板、 引物，4种dNTP的浓度和循环参数下，PCR的反应缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从贮存液中单一加入的，并按0.5mmol/L的梯度递增进行(0.5～5.0mmol/L),之后同时进行PCR, 并检测产物，选择特异性和产掀最优的Mg2+。如果需要进一步优化，可以在该浓度上下，以0.2mmol/L递增或递减来精确确定Mg2+的最佳浓度。需要注意的是，现在商品化的试剂反应体系都是优化好了的，实际操作没有这么麻烦。

2、退火温度：

一般低于Tm的5℃左右，退火温度太低会发生错配，可以通过梯度退火温度PCR仪来优化反应的退火温度，即在正式实验前，在确定了其他反应参数的情况下，按照实验的需要， 设置适当的梯度退火温度， 以0.5℃递增进行（如50.5、51.0、51.5…), 优化出最适退火温度。

3、促进剂：

在PCR体系中加入一些适当浓度的辅助物，如DMSO(二甲基亚砜）、PEG-6000 (聚乙二醇6000 )、甘油、 甲酰胺、非离子去污剂等，以降低碱基错配率或提供PCR的扩增效率。 这些辅助物即为PCR促进剂。大多数的PCR促进剂在高浓度时会抑制PCR，因此在具体实验中，应根据PCR反应体系中特定的模板和引物的结合情况，选择PCR促进剂的最适浓度，但也会存在抑制。

4、引物设计：

借助计算机引物设计软件来达到优化引物。

5、变性温度：

变性温度过高或变性时间过长都会导致DNA聚合酶活性的丧失，从而影响PCR产物的产量。 变性温度过低或变性时间过短则会导致DNA模板变性不完全，使引物无法与模板 结合同样会导致 PCR反应的失败。通常情况下，95℃变性20～30秒即可使各种DNA分子完全变性。

6、延伸条件的优化：

延伸温度取决于所用的DNA聚合酶的最适温度，通常为70～75℃5。延伸温度要求比较严格，一般不可随意更改。有时延伸温度相差1℃就可导致PCR反应的失败。延伸时间取决于扩增片段的长度。目的片段小500bp时，所需延伸时间为20秒；目的片段在500～1200bp时，延伸时间需40秒；目的片段大于1200bp时，则还需增加延伸时间。另外，还可以5OObp/30秒为基准，根据目的片段的长度计算反应时间。目的片段小于150bp时可以省略延伸步骤，因为退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列的合成。

7、循环次数：

PCR反应的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次，此时PCR产物的累积可达到最大值。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，自身发生结合而不与引 物结合导致扩增效率的降低；另一方面，随着循环次数的增加，DNA聚合酶活性下降，引物与dNTP浓度也下降，会出现“平台效应”，也容易发生错误掺入，使非特异性产物增加。因此在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。

8、热启动PCR：

将PCR反应混合物置于低千Tm值的温度下时，在极短的时间内即可产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。这种方法是在加入DNA聚合酶之前，先将PCR反应体系升温至95"C,预变性 2～5分钟后 ，将仪器设在暂停，在这一高温条件下迅速加入DNA聚合酶后再恢复循环。热启动可以防止模板变性不充分，同时还避免了DNA聚合酶活性的迅速下降。

9、模板：

含有靶序列的模板DNA可以单链或双链形式加入PCR反应体系中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA（＞10kb)作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增效果更好。在PCR反应各项条件控制最佳时，仅单拷贝的靶序列作模板也能获得满意的结果，然而更多的情况是靶序列DNA的几千个拷贝数的模板量加人反应体系中。用哺乳动物基因组DNA作模板时，每个PCR反应所加入的模板约为1.0µgDNA, 它相当于常染色体单拷贝基因的约3*l05拷贝数的DNA量。酵母、细菌与质粒DNA作为PCR模板时，每个反应中典型的模板量依次是IOng,1ng和lpg。

最后，分享一本PDF书籍，免叮当下载！