【基础教学帖子】只用NCBI进行引物设计

医疗行业从业者 · 发布于 2022-02-24 · IP 广东广东

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以GAPDH为例

步骤

1、查找序列

选择数据库（GENE），在搜索框输入基因名称

在显示结果页，右边点击自己所需要的种属

在下列结果中根据注释（Aliase），也即是基因别名，选择自己要的基因

页面跳转，把页面滚到下面，出现（NCBI Reference Sequences (RefSeq)），有严格需要的可以根据圈圈内的表达的蛋白亚基，选择框框内的mRNA

页面跳转，把页面滚到下面，出现（CDS）转录区，如果是lncRNA等是没有这个的，那就得看其他的序列分组，不同的序列分组可能表达的基因亚型不一样，可以根据紫色框框的名称判断，这个在找microRNA中比较常见。

比如一个microRNA132

点击（CDS）会跳出一个框，点击（FASTA）

跳转新页面，复制序列

2、设计引物

将序列粘贴在（PCR-Template）框里

输入想要的产物长度：qPCR的一般建议在120-200bp，PCR电泳的一般建议在300-500bp

输入引物数目，常见的基因十对引物差不多了，不常见的自己写多一点慢慢筛

输入自己想要的 TM退火温度，因为我们引物使用量非常大，所以习惯性设计到60℃左右，可以避免弄混

在（database）选择数据库，此处我们设计的是mRNA引物，所以用mRNA库，但如果是设计lncRNA就需要选择RNA库，否则出来的引物没有特异性

在（organism）输入物种

勾选其他窗口展示，点击输出

网页比较卡，一两次不行，建议等等再刷新

3、选择引物

1）选择图示中中部或尾部的序列，因为我们的试剂盒使用oligoDT进行逆转录，从后边开始反应，这样可以减少错配

2）看引物评分self complementarity＜5，且与Self 3' complementarity一样，正反向引物的评分和越小越好

3）GC含量在40-60%之间，一般CG含量越高，Tm值越低，我习惯设60℃左右，所以一般会在55-60

4）3`端以G或C结尾，避免以A结尾

5）引物长度在18-30个bp，一般引物越长，Tm值越高，我习惯设60℃左右，所以一般会在20个左右

6）避免出现4个以上的一碱基或者二核苷酸重复序列，如（CCCC或TATATATA），也有要求少于三个的

7）看每对引物下面的提示，会提示可能出现的特异性产物，根据他的产物尽量避免选择会出现非预期产物的引物对

如果实践中出现问题，欢迎交流

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