超全！跨内含子引物设计【pubmed+primer 5+oligo互补取优法】

以下介绍基本原理和快速入门的两种思路步骤

引物基本要求：提高扩增效率和特异性，尽可能抑制非特异性扩增。因此要考虑以下几点（详细见附件，以下提供要点）

1、长度：

2、扩增跨度：（1）长度： （2）设计跨内含子的引物：

3、引物成分

4、Tm：Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm 值5~10℃。可按公式Tm=4×（G+C）+2×（A+T）-4℃计算。

5、△G：△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

6、避免互补序列：

（1）自身互补序列：   （2）引物二聚体：

7、3’端：引物3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，特别是最末级倒数第2个碱基，以避免末端碱基不配对而导致PCR失败。

8、5’端：仅限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大。引物的5’端可以修饰，而 3’端不可修饰。

9、特异性：引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性，不应有连续8个碱基与待扩增区外序列完全互补。可对其进行BLAST检测进行验证。

以下提供（1）从pubmed pick primer到primer premier 5到oligo；（2）从primer premier 5到pubmed blast到oligo两种思路，由于字数限制，具体步骤见附件