引物设计（NCBI）

个人比较喜欢用NCBI设计引物，其功能强大，不用装软件或者插件，Get Primer和Blast一次性满足，非常Nice！下面分享一下我的引物设计方法。

1.首先在Gene里输入基因名称和物种。

2.点开mRNA序列，有可变剪切的一般用变体1(transcript variant X1)，选择CDS序列，FASTA后直接Pick primers。

3.条件选项栏，产物大小首选100～300（第一次没有合适的话，第二次换成100～700），Tm最适60（第二次可将最大值提高），底下输入你的物种或相应代码。

4.在结果里（最多显示10个）选择最佳。

原则是：首先引物需要是特异性的（在引物下的产物里只有目的基因，可以是其变体，但不能是其他)；3'端避免A、TT、连续GC；引物GC含量不超过60；自连碱基不超过4；两引物互补碱基不超过4（这里可以借助DNAMAN，可直观看引物自身互补和两引物互补性，3'端发夹结构等）；上下游温度相差1内最好（越小越好）。

5.选好引物后，拉到最下面点BLAST

6.可以选核酸Blast和引物blast，看引物的序列来源、特异性及其他信息。