【资源】Pull down实验

最近看了几篇关于Pull down的实验，比较感兴趣就总结分享在这儿，供大家相互学习！

1、Pull down技术的基本原理：

是将一种蛋白质固定于某种基质上（如琼脂糖），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

 为了更有效地利用pull down技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白（或者叫标签蛋白）的形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。比较常用的就是GST（谷胱甘肽-S-转移酶）、6*His（6个连续串联的组氨酸六肽），［其他标签蛋白可以参考附件，GST和6*His为标签的pull down见附件］。

pull down流程图

在这里以GST为例：1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有谷胱甘肽（GSH）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白，

实验过程：

一般来说，GST融合蛋白pull down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。为排除假阳性所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白存在的条件下，将样品结合到GST上。该对照可以是表达有GST（非诱饵融合蛋白）的分别转化细胞裂解物，也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中。设计合适的对照实验非常重要。该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。

注意，Pull down实验一般用于体外转录或翻译体系，如酵母双杂交系统中检测蛋白质之间的相互作用。但并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用，因为在体内它们不一定空间上有碰到，所以并不意味着在生理条件下一定结合。

2、DNA pull down：是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具。

原理：

该技术将生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与细胞核蛋白孵育，纯化出与DNA片段互作的蛋白，洗涤洗脱得到的蛋白产物，做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合；做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。

生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用；其中活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联。因此用生物素标记核酸后，可以纯化出与该核酸结合的各种生物大分子复合物。生物素与链霉亲和素的引入，极大提高了反应的敏感性（或者叫灵敏度）

大概过程：

首先针对靶标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记，跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合；纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，再经过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。（详细步骤可以参考附件）

应用：DNA pull-down主要用于目的DNA片段的互作蛋白（如转录因子等）筛选。

也可以参考

3、RNA pull down：RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

原理：

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。

RNA/DNA pull down实验流程

详细步骤参考附件，仅供参考，有更好的资源可以在评论区相互交流学习！