细节决定成败，这些WB实验小细节你注意到了吗？

WB实验中抗体的优劣是至关重要的一项，但是实验操作过程中的一些小细节也会对最终结果产生很大影响。今天，我们就按照WB实验流程来细化分析，哪些操作会影响最终实验结果。

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一、样本处理

#1

蛋白降解 

常见问题1：样本不新鲜，处理过程中长期处于室温造成样本降解；这种情况最容易造成的结果就是出现“白板”或者目的带下方出现多条杂带

解决办法：

这种情况就只能重新获取样本，处理过程要快速准确，操作过程尽量把样本置于冰盒中。

常见问题2：裂解液中未加酶抑制剂

解决办法：一般酶抑制剂和裂解液的比例是1：100，原则是现用现加。如果做磷酸化抗体，就需要在已经加过蛋白酶抑制剂的裂解液中加入磷酸酶抑制剂，比例也是1：100。

#2

样本蛋白浓度不合适

以下是浓度不合适，造成的结果：

*上图释：这种属于蛋白量太大，一抗浓度和时间太长，就需要调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

解决办法：

我们一般需要对抽提的蛋白进行BCA定量测定浓度，然后通过加不同比例的上样缓冲液把所要用到的蛋白统一调到3mg/ml，然后进行后续的电泳实验。

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二、配胶电泳

#1

条带不平整

解决办法：

查阅资料，根据要做的抗体选用合适浓度的凝胶，加水液封时尽量缓慢，使浓缩胶和分离胶的交界为水平的线，拔梳子尽量平稳，避免点样孔面出现突起导致最终条带为拱形。

#2

如何确定目的蛋白条带的大概位置

解决办法：

点marker可以确定蛋白的大概位置，方便剪膜同时孵育抗体和内参。另外，marker对转印结果的好坏也有一定的指示作用。若转膜结束后，膜靠近凝胶的一面有清晰均匀的条带，则证明转膜效果良好，可进行后续实验。

若转膜结束后，膜靠近凝胶的一面条带较浅，则需观察膜的另一面，如果没有条带，就证明转膜时间不足，需要增加转膜时间；如果有很强的条带，则需要重新电泳，缩短转印时间。

*上图释：10%凝胶，电泳时间2.5h（浓缩胶80V 30min，分离胶100V 120min），转膜70min的结果。

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三、转膜

常见问题：

转膜不充分或者过转印，都会造成结果出现“白板”。

解决办法：

首先可以使用丽春红对转印后的印迹膜进行染色，若无条带可再增加转印时间；若有条带，则可用TBS洗液洗2-3次，然后进行后续实验。

同时也可以用考马斯亮蓝对胶进行染色，若还可看见较强的条带，则还需增加转膜时间，若只能看见较弱的条带，则证明转模时间基本合适。

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四、孵育抗体

如果你的结果有大片的水渍状的黑色背景，那就是孵育或者洗涤过程中出现液体不够造成干膜的情况，这种情况就要重新进行电泳跑胶了

而下面的这种情况就可能是孵育用的二抗中含有未充分溶解的脱脂奶粉，这种情况可以用印迹膜再生液彻底洗掉一抗、二抗，然后重新孵育抗体。

另外，如果选用的内参与使用的一抗分子量较为接近，也可以用这种方法进行内参抗体的实验。

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五、发光显色

当进行发光显色时，无论增加多长的曝光时间，你的结果条带依然很弱时，就要考虑换灵敏度更高的发光显色液了。这种方法对于一些磷酸化抗体尤为有效。

而条带中间出现白色（反白）的情况是因为中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了。需要降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。