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ChIP实验心得总结,有些误区一定要注意!

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    您的案例《ChIP实验心得总结,有些误区一定要注意!》 经同行评议,被丁香园临床病例数据库收录。
收录时间 2025年5月25日
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发布于 2022-08-04 · 浏览 3121 · IP 浙江浙江
这个帖子发布于 2 年零 295 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

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做 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)已经几个月了,虽时间不长,但深刻体会细节决定成败,这里就把自己认为值得注意的细节总结如下:

1、cell counting:尽量做到准确,会影响 input 结果。 

2、cross link:甲醛的终浓度是 1%,这个基本所有的 protocol 上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的 tip 头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,后面的 sonication 就麻烦了。

4、sonication:ChIP 中最重要的一部分,合适的条件要自己摸索,可以一次尝试不同次数的 sonication,然后建议采用 EZ-ChIP 上推荐的方法看看 sonication 的效果如何。 

5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混匀,因为salmon sperm DNA 是很粘稠的物质,若不混匀,后面你会发现 beads的量不一样,自然也会影响实验的结果。 

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净,但最后一个要尽量吸干净,必要时可用 gel loading tips 吸。

7、含 beads 的 samples 离心时,有的 protocol 上推荐是 1000rpm,45 秒,但可以根据情况调整,但要注意转速不能太快防止beads 破碎。(当然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在这个问题)

8、reverse crosslink 可以是 65°4 个小时,也可以 overnight。

9、reverse crosslink 后的在进行下面步骤之前建议先离心,把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。 

10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。

11、1~10ul 的*取 3ul 以上才比较准确,所以考虑好自己 PCR 反应体系的配置。

12、一个 ChIP 一般需要 3~4 天的时间,其中有几个步骤是可以停下来的:

1)细胞收集:用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤离心,去上清的细胞收集液可置 -80° 冻存; 

2)用 SDS 重悬细胞后可置 -80° 冻存;

3)sonication 结束,离心后的上清置新的离心管后可 -80° 冻存;

4)reverse cross-link 后的标本可 -80° 冻存。

13、agarose beads 的 wash 过程中以及后面的 DNA 提取过程中乙醇的 wash,可以用细胞室的那种吸引器,接上 200ul 的 tip 头吸,这样会节省很多时间(每个实验室情况可能不一样)。

14、DNA 提取后建议用水溶解 DNA,因为 TE buffer 里的 EDTA 可能会影响 PCR 反应体系中的 Mg2+。

15、溶解 DNA 的水量可以根据 PCR 反应体系的要求适当调整。



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最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 3121

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