【求助】为何RT-PCR条带呈阶梯状？
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:(
我自己设计的引物,跨内涵子Primer5.0评分98分,没有二聚体,错配,发卡结构.Tm55.2/54.1.产物大小466bp.基因名称SMPD1,gene ID 6609
PCR体系(50ul):10×buffer 5ul,
dNTP 1ul,
MgCl 2ul,
上下游引物各1.5ul,
cDNA 5ul,
Taq酶0.5ul
灭菌双蒸水33.5ul
循环设置:94度3分钟,94度 45秒,55度 30秒,72度 1分30秒,35个循环,72度 10分钟,4度 forever
电泳:2.0%琼脂糖,100V,20分钟
结果如图
内参是353bp,跑了很多次内参都很好,但是目的总是呈梯带状,是我的引物不好吗?这是我第一次设计引物,第一次做RT-PCR,请各位有经验的大侠帮忙分析一下,不胜感激!!!
mRNA:1 atgccccgct acggagcgtc actccgccag agctgcccca ggtccggccg ggagcaggga
61 caagacggga ccgccggagc ccccggactc ctttggatgg gcctggtgct ggcgctggcg
121 ctggcgctgg cgctggctct gtctgactct cgggttctct gggctccggc agaggctcac
181 cctctttctc cccaaggcca tcctgccagg ttacatcgca tagtgccccg gctccgagat
241 gtctttgggt gggggaacct cacctgccca atctgcaaag gtctattcac cgccatcaac
301 ctcgggctga agaaggaacc caatgtggct cgcgtgggct ccgtggccat caagctgtgc
361 aatctgctga agatagcacc acctgccgtg tgccaatcca ttgtccacct ctttgaggat
421 gacatggtgg aggtgtggag acgctcagtg ctgagcccat ctgaggcctg tggcctgctc
481 ctgggctcca cctgtgggca ctgggacatt ttctcatctt ggaacatctc tttgcctact
541 gtgccgaagc cgccccccaa accccctagc cccccagccc caggtgcccc tgtcagccgc
601 atcctcttcc tcactgacct gcactgggat catgactacc tggagggcac ggaccctgac
661 tgtgcagacc cactgtgctg ccgccggggt tctggcctgc cgcccgcatc ccggccaggt
721 gccggatact ggggcgaata cagcaagtgt gacctgcccc tgaggaccct ggagagcctg
781 ttgagtgggc tgggcccagc cggccctttt gatatggtgt actggacagg agacatcccc
841 gcacatgatg tctggcacca gactcgtcag gaccaactgc gggccctgac caccgtcaca
901 gcacttgtga ggaagttcct ggggccagtg ccagtgtacc ctgctgtggg taaccatgaa
961 agcacacctg tcaatagctt ccctcccccc ttcattgagg gcaaccactc ctcccgctgg
1021 ctctatgaag cgatggccaa ggcttgggag ccctggctgc ctgccgaagc cctgcgcacc
1081 ctcagaattg gggggttcta tgctctttcc ccataccccg gtctccgcct catctctctc
1141 aatatgaatt tttgttcccg tgagaacttc tggctcttga tcaactccac ggatcccgca
1201 ggacagctcc agtggctggt gggggagctt caggctgctg aggatcgagg agacaaagtg
1261 catataattg gccacattcc cccagggcac tgtctgaaga gctggagctg gaattattac
1321 cgaattgtag ccaggtatga gaacaccctg gctgctcagt tctttggcca cactcatgtg
1381 gatgaatttg aggtcttcta tgatgaagag actctgagcc ggccgctggc tgtagccttc
1441 ctggcaccca gtgcaactac ctacatcggc cttaatcctg gttaccgtgt gtaccaaata
1501 gatggaaact actccaggag ctctcacgtg gtcctggacc atgagaccta catcctgaat
1561 ctgacccagg caaacatacc gggagccata ccgcactggc agcttctcta cagggctcga
1621 gaaacctatg ggctgcccaa cacactgcct accgcctggc acaacctggt atatcgcatg
1681 cggggcgaca tgcaactttt ccagaccttc tggtttctct accataaggg ccacccaccc
1741 tcggagccct gtggcacgcc ctgccgtctg gctactcttt gtgcccagct ctctgcccgt
1801 gctgacagcc ctgctctgtg ccgccacctg atgccagatg ggagcctccc agaggcccag
1861 agcctgtggc caaggccact gttttgctag
正义链：5‘GCCAGGTTACATCGCATAGT 3’
反义链：5‘GTGCCCTCCAGGTAGTCAT 3’
Rating 位置 长度 Tm GC 最适Tm
sense 100 205 20 55.2 50
antisense 100 650 19 54.1 57.9
product 98 446 92.6 59.6 56
我自己设计的引物,跨内涵子Primer5.0评分98分,没有二聚体,错配,发卡结构.Tm55.2/54.1.产物大小466bp.基因名称SMPD1,gene ID 6609
PCR体系(50ul):10×buffer 5ul,
dNTP 1ul,
MgCl 2ul,
上下游引物各1.5ul,
cDNA 5ul,
Taq酶0.5ul
灭菌双蒸水33.5ul
循环设置:94度3分钟,94度 45秒,55度 30秒,72度 1分30秒,35个循环,72度 10分钟,4度 forever
电泳:2.0%琼脂糖,100V,20分钟
结果如图
内参是353bp,跑了很多次内参都很好,但是目的总是呈梯带状,是我的引物不好吗?这是我第一次设计引物,第一次做RT-PCR,请各位有经验的大侠帮忙分析一下,不胜感激!!!
mRNA:1 atgccccgct acggagcgtc actccgccag agctgcccca ggtccggccg ggagcaggga
61 caagacggga ccgccggagc ccccggactc ctttggatgg gcctggtgct ggcgctggcg
121 ctggcgctgg cgctggctct gtctgactct cgggttctct gggctccggc agaggctcac
181 cctctttctc cccaaggcca tcctgccagg ttacatcgca tagtgccccg gctccgagat
241 gtctttgggt gggggaacct cacctgccca atctgcaaag gtctattcac cgccatcaac
301 ctcgggctga agaaggaacc caatgtggct cgcgtgggct ccgtggccat caagctgtgc
361 aatctgctga agatagcacc acctgccgtg tgccaatcca ttgtccacct ctttgaggat
421 gacatggtgg aggtgtggag acgctcagtg ctgagcccat ctgaggcctg tggcctgctc
481 ctgggctcca cctgtgggca ctgggacatt ttctcatctt ggaacatctc tttgcctact
541 gtgccgaagc cgccccccaa accccctagc cccccagccc caggtgcccc tgtcagccgc
601 atcctcttcc tcactgacct gcactgggat catgactacc tggagggcac ggaccctgac
661 tgtgcagacc cactgtgctg ccgccggggt tctggcctgc cgcccgcatc ccggccaggt
721 gccggatact ggggcgaata cagcaagtgt gacctgcccc tgaggaccct ggagagcctg
781 ttgagtgggc tgggcccagc cggccctttt gatatggtgt actggacagg agacatcccc
841 gcacatgatg tctggcacca gactcgtcag gaccaactgc gggccctgac caccgtcaca
901 gcacttgtga ggaagttcct ggggccagtg ccagtgtacc ctgctgtggg taaccatgaa
961 agcacacctg tcaatagctt ccctcccccc ttcattgagg gcaaccactc ctcccgctgg
1021 ctctatgaag cgatggccaa ggcttgggag ccctggctgc ctgccgaagc cctgcgcacc
1081 ctcagaattg gggggttcta tgctctttcc ccataccccg gtctccgcct catctctctc
1141 aatatgaatt tttgttcccg tgagaacttc tggctcttga tcaactccac ggatcccgca
1201 ggacagctcc agtggctggt gggggagctt caggctgctg aggatcgagg agacaaagtg
1261 catataattg gccacattcc cccagggcac tgtctgaaga gctggagctg gaattattac
1321 cgaattgtag ccaggtatga gaacaccctg gctgctcagt tctttggcca cactcatgtg
1381 gatgaatttg aggtcttcta tgatgaagag actctgagcc ggccgctggc tgtagccttc
1441 ctggcaccca gtgcaactac ctacatcggc cttaatcctg gttaccgtgt gtaccaaata
1501 gatggaaact actccaggag ctctcacgtg gtcctggacc atgagaccta catcctgaat
1561 ctgacccagg caaacatacc gggagccata ccgcactggc agcttctcta cagggctcga
1621 gaaacctatg ggctgcccaa cacactgcct accgcctggc acaacctggt atatcgcatg
1681 cggggcgaca tgcaactttt ccagaccttc tggtttctct accataaggg ccacccaccc
1741 tcggagccct gtggcacgcc ctgccgtctg gctactcttt gtgcccagct ctctgcccgt
1801 gctgacagcc ctgctctgtg ccgccacctg atgccagatg ggagcctccc agaggcccag
1861 agcctgtggc caaggccact gttttgctag
正义链：5‘GCCAGGTTACATCGCATAGT 3’
反义链：5‘GTGCCCTCCAGGTAGTCAT 3’
Rating 位置 长度 Tm GC 最适Tm
sense 100 205 20 55.2 50
antisense 100 650 19 54.1 57.9
product 98 446 92.6 59.6 56
