设计引物进行PCR发现非特异性条带产量极高，改良反应条件和引物序列后效果不明显

想咨询各位前辈有无比较好用的引物设计、分析工具，能够评价同源重组引物和预测其主要可能的结合位点。

最近用Snapgene设计了两条用于同源重组的引物（含同源臂，能在snapgene上进行模拟PCR，in-fusion clone），KOD plus酶，58℃退火温度下不能得到很亮的目标条带，反而非特异性条带非常亮，回收浓度在4 ng/ul。

通过Oligo 6进行分析，发现预测结果是根本不能生成任何产物；利用benchling在线工具进行分析发现其首先配对的位置不在目的片段两侧。

根据先前的经验我删除了同源臂上的EcoRI酶切位点序列，确实产量稍有提高但非特异性条带（100-200bp）仍然非常亮。尤其使用Touch-Down方法产量更高一点，我预计退火温度再高一些（65℃-67℃）产量应该会更好

打算直接用现在这个目标条带做之后的实验，但是这个低产量的问题不知道怎么解决，因为我引物的位置和基础的序列已经不可能变化了，想再听听各位前辈的建议。

不过还没有尝试增长特异性引物区域，但是延长之后GC含量又比较高。