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【分享】慢病毒包装遇到的坑和解决的路。。

最后编辑于 2022-10-09 · IP 浙江浙江
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这个帖子发布于 5 年零 312 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近有几位加了我q来问我慢病毒包装的问题。。说实话,这东西理论和操作都很简单,但是有的时候就是包不出来,除了rp问题之外,大多数是有些细节木有注意到。。今天就打几个字分享一下,我在N久之前自学病毒载体的时候,遇到过的坑和最终解决获得的经验值。。。。另外,【问试剂的,站短我留你的q,我不会在帖子里详细说明小众品牌,以避免广告嫌疑。来我帖子下面做广告的,请自动消失远点,我确定用的不是你家的试剂】

1.怎么包都不出毒

如果质粒是要来的,那么先问问源实验室是否用这一套包出来了。另外,给你的是新抽的还是原来人家包出来病毒的那一管里面分装的。很多人包不出的原因,就是质粒问题(我第一次就遇到这个问题,坑死我了,小半年啊,那时候我啥都不懂)。如果人家包出来是work的,到了自己手里,不出毒。那么,对每个质粒进行酶切鉴定,看一下条带大小是否符合预期(必须获得质粒的全序列,没有全序列的质粒最不保险)。有人说:“我转染的时候荧光很好呀,但是不出毒怎么办,转染好说明质粒应该没问题的。。”我要说,上面这句话完全是错误的!有荧光只能说明主载体中荧光部分的表达框是没有问题的,不能说明主载体的全部元件都是完整的。可能有一些必须的结构产生了突变或缺失,导致最终病毒滴度特别低,甚至不出毒。解决办法:转化慢病毒载体及辅助质粒时,都使用NEB stable 或者Invitrogen Stbl3菌株进行分子克隆和转化,最大程度避免突变和分子内同源重组导致的元件缺失。其中需要注意的是不仅主载体,辅助质粒也有可能产生突变,因此,扩增时所有载体建议都用这两个菌株。

2.出毒效率低,感染荧光弱

慢病毒出毒的话,50%左右转染效率就差不多了。但是想出毒效率高,当然转染效率越高越好。我自己做过的经验大概70%左右的转染效率,对应原液的滴度10的6次方;接近100%的转染效率,对应原液的滴度10的7-8次方。当然这和载体的大小也有关系。一般载体每增加1kb,滴度下降一个数量级。因此,想产生高滴度的慢病毒,转染效率越高越好,那么,请确认以下几点:用低代数的细胞(非常重要)、第1天铺板第2天转染转染时密度接近85%。其中,低代数的Hek细胞能够确保较高的转染效率,随着传代次数的增加,细胞的形态和转染效率都会改变。正常情况下,低代数的Hek细胞随便转,效率都能达到70%左右。如果你们实验室的Hek细胞转染效率只有30-40%,那么请首先考虑更换低代数的细胞吧。这里需要补充的是,包慢病毒用的细胞不一定非要是Hek293T,亲测Hek293也好用。转染时密度为85%,是因为此时转染效率较高,并且随着时间推移,病变的细胞还可连成团,不至于漂了。(给2个图瞻仰下吧,高转染效率导致肉眼可见的荧光,此时细胞很多会变圆并连成呈葡萄串状。)不同转染试剂对于转然后是否换液有不同要求,个人推荐安全起见,6-12h换一次5-10%FBS的完全培养基,补充双抗。生长非常迅速的细胞,还可以考虑在培养基中添加5-20mM的Tris(调pH7.2-7.4),用以减少pH波动,稳定病毒颗粒。

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3.慢病毒浓缩效率低下

有超速离心机的,可以考虑超离7-10wg,1-2h即可,安全起见可以在底部预加入几mL的蔗糖垫。没有超速离心机的,可以考虑使用病毒浓缩液。病毒浓缩液需要注意,与病毒原液混合后,必须置于低温环境(4℃),进而产生缓慢的沉淀析出。而这种缓慢的沉淀析出具有巨大的比表面积,能够将蛋白和病毒颗粒携带沉淀出来。室温会影响试剂成分的析出,从而导致浓缩效率低下。另外,也许低FBS对病毒颗粒的沉淀更有帮助(减少了蛋白与析出成分的相互作用,相对增加了病毒被沉淀下来的概率,我猜的哦)。沉淀量会很少,如果病毒原液小于15ml,那么沉淀可能不可见。此时应小心的吸弃上清,而不是倾倒,从而避免损失,以及管壁上残留的液体对沉淀的稀释。我个人喜欢加无血清的下游培养基重悬沉淀,以减少重悬后悬浊液的粘度(此时需要注意的是,重悬时没必要稀释至澄清透明,悬浊液即可作为stock置于-80℃分装保存)。感染时与下游培养基按一定比例混合,只要没有明显毒性就可以,记得补充双抗以及polybrene。(常规原液在48-72h可见荧光,72-96h达到表达高峰。顺便盗个图说明一下,很高滴度的病毒,甚至可以在24h以内就能看到荧光。)

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累了,先bb这么多,有啥问题留言~装死去了...


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