基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之单碱基编辑

本来国庆节想偷个懒，但是想想还是把这个系列的内容做个ending。在这里祝各位老铁国庆节快乐。

第一节介绍了基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术（基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之基因敲除）；

第二节给大家分享了基于Cas9同源重组修复点的突变和外源基因敲入（基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之点突变/外源基因敲入）；

第三节和大家一起学习了基于Cas9的基因激活和基因失活（基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之基因激活和基因失活），想要了解相关内容的同学自己点击相应的链接查看，今天第四讲咱俩聊一聊基于Cas9的单碱基编辑技术。

（4）与上一节讲到的基于Cas9的基因表达激活和失活原理类似，基于Cas9的单碱基编辑技术也是利用到失活的Cas9再融合相应的核苷酸脱氢酶，利用sgRNA的靶向性携带dCas9-脱氢酶复合物到相应的位点对窗口内的靶点碱基进行编辑。2016年，David Liu教授团队在Nature杂志报道了首个单碱基编辑器，标志着基因编辑进入了单碱基编辑时代。该文章对不同的脱氨酶种类、融合位置及linker的选择进行优化，得到具备较好单碱基编辑能力的第一代编辑器rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI，实现了特定位点C>T的碱基转换（图1）。一年之后，该团队有开发了能实现A>G碱基转化的ABE碱基编辑器（图2）。在2019年，David Liu团队开发了能实现任意碱基转化的编辑器PE工。首先，团队基于nCas9（H840A）和逆转录酶构建融合蛋白，同时对sgRNA进行改造，得到第一代PE。之后该团队对逆转录酶进行工程化改造制备了第二代PE，提高了单碱基编辑效率。随后，又对断裂非编辑链进行改进，得到编辑效率更高的第三代PE。然而，目前绝大多数实验室复现的编辑效率很低，在一定程度限制了PE的应用。在2021年，David Liu教授与普林斯顿Adamson教授团队合作，开发出第四代与第五代PE系统，利用CRISPRi技术鉴定发现MMR通路能影响PE的编辑效率。团队发现共表达MLH1能显著提升PE编辑效率，随后对MLH1进行截短实验发现其MSH2 binding结构域发挥关键功能。最终，团队在PE2和PE3的基础上，共表达MLH1dn蛋白，能显著提升PE编辑效率，这样的系统被称为PE4和PE5（图3）。

图1：单碱基编辑器BE及其工作原理（PMID: 35189910）。

图2：单碱基编辑器ABE及其工作原理（PMID: 35189910）。

图2：单碱基编辑器PE及其工作原理（PMID：31634902）

碱基编辑器作为一项新型的基因编辑技术，备受基因编辑领域专家的关注，一直是研究的热点。该工具的面世填补了经典的Cas9技术无法涉及的领域空白。虽然BE，ABE和PE等碱基编辑器仍存在一定的弊端和瓶颈亟待突破，但是我相信在不久的将来通过科学家们的不懈努力，最终能制备出临床适用的单碱基编辑器，为遗传性疾病患者的基因治疗带来福音！

参考文献

[1]Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, Cai JB, Zhang PF, Cui YH, Ke AW. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022 Feb 21;21(1):57. doi: 10.1186/s12943-022-01518-8.

[2]Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, Liu DR. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019 Dec;576(7785):149-157. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4.

[3]Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4. doi: 10.1038/nature17946.

[4]Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644.