PCR产物酶切后连接，连不上。

目的片段3.5kb，上下游引物5’ 端各加入BamHI 和XhoI酶切位点和三个保护碱基。PCR扩增条带正确。切胶回收。

pET-SUMO载体是别人给的，没有序列，可能是在pET-21a的基础上加了SUMO 标签改造的，已连了一段目的基因，可用BamHI 和XhoI双酶切将已连的目的基因和载体切开，将我的目的片段连上。

我将目的片段回收产物用NEB的BamHI 和XhoI双酶切过夜 

50μl Reaction  

10×NEB3.1  5μl  

DNA 30μl（2μg左右）

BamHI 1μl

XhoI 1μl

DEPC 水 13μl

37℃ 酶切过夜。

酶切后跑胶验证条带正确，回收。回收后浓度约50ng/μl,30μl.

将载体也双酶切，胶图可以看出载体被切成两段，一段大概5.7kb，一段大概2kb。将酶切产物5.7kb片段胶回收后, 浓度约20ng/μl,30μl.

使用NEB的快速连接酶将目的片段和载体连接，20μl体系片段150ng, 载体80ng，25℃连接5min. 转化后平板上却无菌落长出。阳性对照有菌落。

请教各位大神，是哪里出了问题？因为目的片段酶切后看不出来是否切开，所以不知道是酶切没有切开，还是连接没有连上。