IP效率低下,求大神赐教,谢谢!
1.用匀浆器加RIPA裂解液(普利莱C1053)提取组织中的总蛋白,用BCA法测定浓度约5ug/ul。
2.没有进行预吸附,直接将总蛋白原液150ul与2ug抗体结合,4℃摇过夜。
3.拿出proteinA/G beads(santa cruz,sc-2003)60ul,用预冷PBS洗2遍,2500rpm,1min,4℃离心,最后用PBS把beads配成50%浓度,将与抗体结合过夜的蛋白原液加入含有beads的ep管中,4℃摇4h。
4.用预冷PBS洗三遍,每摇10min后用4℃离心机2500rpm,1min。
5.100℃,煮10min。
6.做WB。
7.结果:input有条带,ip无条带。
为了验证是IP的效率低下还是被PBS洗脱掉了,遂用ip离心后的上清液(理论上应该不含有或只有少量目的蛋白了)与总蛋白一起行WB,结果提示:input和ip后的上清液无明显差别,遂认为目前首要的问题是IP效率低下。
关于这个问题,处理起来不知怎么办,求大神赐教,谢谢!
查阅了文献,得知我的这种IP抗体和我beads都可以用来做IP,到时没有具体的文献报道,希望大神帮帮我,谢谢

最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1027