【心得】基因定点突变新方法

flyeye战友的帖子“基因定点突变 step by step”通俗易懂，妙趣横生的阐述了经典定点突变方法。
但经典方法有个小小的缺点就是不能对质粒进行指数扩增，很难通过电泳观察判定PCR效果。一旦突变失败，增加了查找失败原因的困难。经典方法为何不能实现指数扩增呢？原因在于完全互补的突变引物与线性化产物5'端结合，是不能延伸的，请看示意图：

因此，我们需要做的就是设法使突变引物能与线性化产物的3端结合，实现指数扩增。如何设计突变引物呢？我们还是通过示意图来说明：

通过上图，我们看到，巧妙的将突变引物设计为部分互补，使其能同时与PCR线性产物的5’端和3’端结合，将线性模版转为环状模版，实现延伸。打个比方，这种互补引物就像创可贴，通过碱基互补将PCR产物的首尾连接，形成环状模版，由此实现指数扩增。下图是利用互补突变引物做的PCR。

后续实验步骤完全和经典突变方法一样。新手可以参考flyeye战友的帖子。这种方法即能大大提高突变成功率，也能对关键的突变PCR进行质控，利于突变失败后的问题查找和分析。当然这么巧妙的方法不是我发明的。TransGen Biotech公司有这种新方法的试剂盒。我们是跟公司要了产品说明书，然后自己DIY的，土豪或者新手也可以直接购买他们的试剂盒。具体的互补引物设计方法请下载说明书（说明书已由lengfeng081386战友上传）。