普拉固对动物激素性股骨头坏死的干预研究

普拉固对动物激素性股骨头坏死的干预研究
摘 要

目的：采用激素（地塞米松，Dexamethasone）制作成兔股骨头坏死(Steroid-induced Femoral Head Necrosis, SIFHN) 模型，探讨普拉固（Pravastatin）对SIFHN干预作用及其机制。
方法：12-18周龄日本大白兔42只，雌雄不限，体重2.5 0.6kg,随机分为4组：空白组（Group A）：6只。对照组(单纯激素组Group B)：12只。小剂量普拉固组（Group C）：12只，普拉固口服5mg/天。大剂量普拉固组（Group D）：12只，普拉固口服10mg/天，各组动物均以标准饲料及草料喂养，除A组外，B,C,D组均以Dexamethasone 2.5mg/kg·d im，用足12周。期间每组均予青霉素80万u/只， im。链霉素1.0g/只，im，2次/周，防止感染。分别于6周，8周，10周，12周处死每组兔子各3只，处死前均检查血脂，血粘度，血PT,t-PA及双髋关节x-ray摄片，处死后取双股骨头行HE染色，标本行光学电镜观察，及透射电镜检查，细胞凋亡分析。
结果: 普拉固组中小剂量组及大剂量组的兔血脂，血粘度 PT, t-PA较激素组均升高 （P<005）。与单纯激素组比较，普拉固组X-ray 示股骨头及髋臼可见软骨下区不规则囊性透亮区及骨化硬化带明显减少，HE染色示骨小梁未见稀疏，骨陷窝空虚率，髓内基质细胞脂肪转化率减低，髓内血管栓子形成减少。透射电镜示骨细胞吞饮脂滴减少。细胞凋亡分析示实验组较对照组骨细胞凋亡指数减少（P<005）。但普拉固这种对SIFHN的干预作用，大小(10mg/d与5mg/d)剂量间不存在显著差异。
结论: 地塞米松能在兔体内成功造成股骨头坏死模型，而他汀类药物普拉固能有效干预股骨头坏死进展，其作用机制可能与降血脂，血粘度，抗凝，从而缓解股骨头血供障碍，减少骨质疏松避免软骨下骨骨折，降低骨内压有关。

关键词: 普拉固 激素性股骨头坏死 干预研究 兔


An Animal Experimental Study of Intervening The Steroid-induced Femoral Head Necrosis(SIFHN) by Pravastatin
Abstract
Object : To build a model of rabbits’ Steroid-induced Femoral Head Necrosis (SIFHN) by administing Dexamethasone(DEX). Discussing whether the Provastatine can intervening the course of resulting in SIFHN and the possible mechanism. Methods: The Japanese rabbits, 12-18 weeks old ,2.5 0.6kg, randomly divided into 4 groups, Group A(n=8): Just used as the control. Group B(purely administering DEX n=12).Group C(n=12): Pravastatin 5mg/d p.o. Group D(n=12): Pravastatin 10mg·d-1 p.o. Every rabbit of group A B C was fed by standard forage and fodder. DEX of 2.5mg·kg-1·d-1 was injeceted to the rabbits except Group A for 12 weeks. Simultaneity, the Penicillin-natrium 80,0000u and streptomycin 1.0g was injected to everyone ,twice a week, avoiding being infected. Every following 6,8,10,12 weeks, 3 rabbits of every group were selected to examined with serum cholesterol and triglyceride, hemorrhelogical factor, PT, tissue plasminogen( t-PA) and double hipcoxa joints were taken an X-ray photograph before they were executed . The specimens of double femoral heads were taken to studied by the light microscope after stained with Hematoxylin and eosin(HE), Transmission Electron Microscope(TEM) and analyse of apoptosis. Result: Comparing with the Group B, the serum cholesterol and triglyceride, hemorrhelogical factor levels of the Group C and D had lowered obviously, PT and t-PA are higher since 6 weeks (P<0.05),X-ray didn’t show the phenomenons of the irregular radiolucent cystic area and ossificational cirrhosis that was found clearly in the subchondral region of the acetabulum and femoral head. Light microscopy exhibit the density of trabecular bone did not change more than Group A. The rate of the empty lacuna and the bone marrow stromal cell transforming to the lipocyte had decreased obviously . There is seldom fat embolus and lipid droplets appearing in the vessels of the osteocytes. Under the TEM, organelle and nucleus of osteocytes were found rarely degenerative, necrotic and swallowing the lipid droplets. The analyse of apoptosis present the AI(Apoptosis Index) was lower than Group B（P<005） .The effect of Pravastatin intervening the course of SIFHN did not show markedly difference between the Group C and D. Conclusion: The Dexamethasone resulted in building the model of rabbits’ SIFHN as the Group B. and the Pravastatin can intervene the couse of SIFHN effectively .The mechanism of action is mightly related with lowering the level of serum lipid and hemorrhelogical factor, releasing the osteoporosis, which would reduce the obstructive possibility of blood supply and the rate of fracture that happened below the subchondral region of femoral head.
Key Words: Pravastatin Steroid-induced Femoral Head Nnecrosis(SIFHN) Intervening study Rabbits
前 言
早在50年代国外就有报道激素与骨坏死的关系，此后大量的实验研究充分证实过量服用激素与股骨头坏死之间的因果关系。其可能的机制是：过量激素的应用①可引起脂质代谢紊乱，继发高脂血症，股骨头血管脂肪栓塞；②导致高粘质血症，血液高凝，低纤溶状态，及微血管炎症损伤，最后导致血栓形成，血供障碍（1）。③造成骨髓基质细胞的脂肪细胞分化肥大，骨内压升高，股骨头血供受阻（2）。④可使股骨头发生骨质疏松，发生软骨下骨折、塌陷、股骨头坏死。一旦出现股骨头顶区塌陷，则预后较差，因此早期发现并予以防治尤为重要。其中MRI检查是早期发现且无创性诊断股骨头坏死的重要方法之一。国内外均以此检查结果作为早期诊断标准。
至今为止，国内外报道多以药物及手术治疗激素性股骨头坏死居多，但对如何预防股骨头坏死只有周谋望等（3）于1996年对动物激素性股骨头坏死应用氯苯丁脂进行防治报道，但具体作用有效剂量及作用机制尚未明嘹。通过对多种药物的遴选，我们发现他汀类降脂药Pravastatin（普拉固）可在前述3种股骨头坏死机制中发挥显著干预作用，表现在普拉固使用可①降低血脂，防止骨细胞脂肪变性坏死及所致的骨内压升高，脂肪栓子形成导致的脂肪栓塞。②抗高凝，促进及恢复股骨头血供。③改善骨质疏松，促进骨重建。我们可以设想该药应用在激素使用患者中，应能有效干预股骨头坏死的发生。本实验拟采用他汀类药物普拉固（Pravastatin）,在已成为标准的贺氏造模法（4）造模过程中加以应用，探讨其是否能对激素引起的股骨头坏死存在干预作用，为今后临床上预防激素性股骨头坏死提供一条新途径。
材料与方法
1. 动物：
日本大白兔42只， 12~18个周龄，雌雄不限，体重2.5+0.6kg。由广西医科大学实验动物中心提供。（图2）
2 .药物、试剂：
普拉固（Pravastatin）：10mg 或20mg/片，上海施贵宝制药公司（卫药准字J-19号）；
地塞米松磷酸钠注射液（Inj DEX）：5mg/amp,天津药业集团新郑股份有限公司（国药准字H41021255）。
血总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）, 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒（日本第一化学株式会社）。
血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA) 试剂盒：福建太阳生物技术公司。
3. 实验场所：
广西医科大学动物实验中心及饲养室。
4.  实验设备：
美国产ACL-Advance 全自动血凝仪
国产普利生LBY-N6A 血液粘度计
荷兰PHILIPS’ V-5000数字x线摄片机
日本产TOSHIBA H-500透射电子显微镜（TEM）
德国产DMR+Q550病理图象分析仪
日本产HITACHI 7170A 血生化全自动分析仪
5．动物实验模型的建立：
参照贺氏造模法（4）：日本大白兔42只，以标准饲料及草料喂食，随机分为4组。第一组（Group A）：6只,单纯标准饲料及草料喂食。第二组(Group B)：激素组:12只，只予地塞米松2.5mg·kg.-1·d.-1, 肌肉注射。第三组(Group C)：普拉固小剂量组，12只，地塞米松2.5mg·kg.-1·d.-1, 肌肉注射,普拉固口服，5mg/天。第四组(Group D)：普拉固大剂量组，12只，地塞米松2.5mg·kg.-1·d.-1,臀 肌注射,普拉固口服，10mg/天。实验期间每组均予青霉素80万u/只， 肌肉注射，链霉素1.0g/只，肌肉注射，2次/周，预防感染。用药前各组兔子均随机抽样5只检查血脂，血黏度，血PT,t-PA ,各组取2只作双髋数字X-ray摄影，了解股骨头形态。其中B组于第4周及第7周因腹泻及消化道出血各死亡1只，C 组于第3周及第7周因兔癞及上呼吸道感染各死亡1只。分别于实验后6周，8周，10周，12周，分别处死各组兔子3只，处死前均行上述血生化检查，及双髋关节X-ray摄片，处死后取双股骨头以福尔马林浸泡固定标本24小时，后同时行HE及细胞凋亡染色，标本行光学电镜观察，及透射电镜检查，行细胞凋亡分析。
6．标本采集与处理：
饲养后6周，8周，10周，12周，各组各随机取2只,先送做双髋关节数字X-ray摄影，后予氯安酮（2.5mg/kg）肌注麻醉后至股静脉采血10ml分别送检血脂，血粘度，血PT,t-PA，处死后取双侧股骨头，分别予10%福尔马林浸泡固定24-48h,分别取股骨头负重区中下1/3共2处软骨下骨面（包括软骨，骨及少部分骨髓），面积约0.5mm2,第一处做普通HE染色，透射电子显微镜检查及细胞凋亡检测。
7．血脂，血粘度，PT测定：
按照试剂说明书进行，用日本产HITACHI 7170A 血生化全自动分析仪国产普利生LBY-N6A 血液粘度计操作。
8．t-PA测定：
取血2 ml与0.13 mol/L枸橼酸钠混合（体积比9∶１）,离心分离血浆。采用发色底物法测定t-PA含量，t-PA活性用国际单位（U）表示。具体按试剂盒说明书进行。由日本产HITACHI 7170A 血生化全自动分析仪完成操作。
9．HE染色后组织坏死程度检查法：
股骨头标本以10%中性福尔马林固定，经脱钙后a)涂片固定15~30分钟。(b)渐进入水 将已固定的涂片集资置于80%、70%、50%酒精溶液，最后置入蒸馏水，各1分钟。(c)染核 涂片浸入苏木素染液中4~5分钟。(d)分色 浸入0.5%盐酸酒精中分色数秒钟，以脱去吸附过多的苏木素染液，自来水冲洗。肉眼观察涂片转为淡红反即可。(e)蓝化 浸入稀碳酸锂溶液中，蓝化2分钟，肉眼观察涂片变蓝色，然后自来水冲洗。(f)渐进脱水 将 染核后的涂片依次浸入50%、70%、80%、95%酒精液中各1~2分钟脱水。(g)染胞浆 先浸入橘黄G6染液中染色2分钟，然后置95%酒精液中洗涤2次。再浸入伊红染液中染色3分钟，然后置95%酒精液中洗涤2次。(h)脱水透明 继续将涂片浸入无水酒精液中（过两缸）、二甲苯中（过两缸），各2分钟。（i）封片 用光学树脂胶加盖片封固。标本片上滴加液体石蜡1~2滴，以利保存，即可镜检。骨组织坏死程度一股骨头下区骨陷窝平均空虚率（%）表示。
10．透射电子显微镜检查方法：
新鲜骨组织尽量切成小块或磨成薄片（约1mm3）,将骨块在0.1mol/L PBS液中充分漂洗后，投入脱钙液中在室温下进行脱钙，约1个月，后置于4ºC 2.5%戊二醛固定24小时，经0.1mol/L PBS液漂洗3次（10分钟/次）后用1%锇酸后固定2小时，再用0.1mol/L PBS液漂洗3次（10分钟/次），用梯度乙醇、丙酮逐级脱水,以环氧树脂618包埋，经60ºC聚合12小时后，制成LKB-V型超薄切片70nm，经醋酸铀-枸橼酸铅双重电子染色在TOSHIBA H-500TEM（透射电子显微镜）下观察。
附脱钙掖及固定液的配方：
脱钙液：EDTA 40-50g 骨组织固定液：多聚甲醛 2g
双蒸水 500ml 双蒸水 25ml
0.2mol/L NaOH 350ml 1mol/L PBS 1~3滴
双蒸水 加至1000ml 25%戊二醛 10ml
11．细胞凋亡检测方法：
采用TENUL法，即原位细胞凋亡检测法，试剂使用武汉博士德公司提供的细胞凋亡试剂盒，产品编号：MK1020。操作方法：（1）、将石蜡切片常规脱蜡入水，务必脱蜡干净。（2）、用新鲜配置的3%H2O2在室温下处理10分钟，用蒸馏水洗涤2分钟* 3次。（3）、标本加0.01M TBS （1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠，1.2克Tris和0.45—0.5ml纯乙酸）和1：200新鲜稀释Proteinase K 37oC消化10分钟，0.01M TBS 洗2分钟x 3次。（4）、标本片加标记缓冲液20ul/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG—dUTP个1Ul，加入18ul标记缓冲液中，混匀，加标记液20ul/片。置样品于湿盒中，37ºC标记2小时。（5）、0.01M TBS 洗2分钟x 3次。（6）、加封闭液50ul/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。（7）、用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体置样品于湿盒中，0.01M TBS洗2分钟x 3次。（8）、用抗体稀释液1：100稀释SABC，37ºC反应30分钟，0.01M TBS洗5分钟x 4次。（9）、DAB现色：取1ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色10—30分钟左右。水洗。（10）、苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗，脱水，透明，封片。（11）、显微镜观察：在40X视野下观察，任选5个视野观察，平均计数100个骨细胞中细胞核染色成棕色颗粒的细胞数目即为凋亡指数（AI）。
12．统计学处理：
全部数据用SPSS10.0统计学软件处理，数据以均数+标准差（x±s）表示，采用成组设计检验进行统计分析，P<0.05表示差异具有显著性，有统计学意义。


结 果
1．一般结果：
实验前后空白组（A）无死亡，兔子精神，食欲正常，毛色光亮，体重明显增多。对照组（激素组 B）兔子精神萎靡，食欲不振，毛色枯槁，消瘦，脂肪呈向心性分布。4周后有3只开始出现蹒跚步态，至第12周每只兔子都出现程度不同程度跛行，行动受限，而且易感染，于第4周及第7周因腹泻及消化道出血各死亡1只；有2只发生臀肌注射区皮肤软组织感染，清创换药后治愈。实验组小剂量组(C)兔子精神稍差，食欲稍减，毛色稍灰暗，体型消瘦，但运动跳跃功能好。于第3周及第7周因兔癞及上呼吸道感染各死亡1只；大剂量组（D）兔子精神尚可，食欲好，毛色无明显变化，无消瘦，行走跳跃正常。
2. 实验前后血脂及血粘度的比较：
实验前后同期对照组(B)较空白组(A)血脂，血粘度（包括各高中低切血粘度，红细胞压积，红细胞聚集指数）显著增高(P<0.05)。同期上述指标实验组较对照组显著减少(P<0.05),与空白组比较虽然有所增高，C,D 组间则无明显差异，但无统计学意义(P >0.05) 。具体见表1，2，3。


表1：各组实验前后血脂比较（x±s）
检测项目 组别 n 实验前 第6周 第8周 第10周 第12周
A 6 1.68+0.31 1.63+0.28 1.65+0.23 1.55+0.15 1.45+0.31 B 12 1.85+0.29 2.02+0.21 2.15+0.28* 2.42+0.14* 3.07+0.34**总胆固醇（mmol/L） C 12 1.96+0.43 1.14+0.20#* 1.00+0.22#* 1.35+0.25# 1.12+0.12##* D 12 1.87+0.23 1.16+0.25#* 1.03+0.31#* 0.89+0.12##* 1.50+0.30## A 6 1.42+0.45 1.35+0.12 1.36+0.34 1.28+0.15 1.25+0.25 B 12 1.02+0.18 1.67+0.21 2.04+0.30* 3.25+0.25* 4.97+0.32**甘油三脂（mmol/L） C 12 1.89+0.32 1.23+0.25 1.29+0.31# 1.85+0.24## 2.38+0.13## D 12 1.09+0.35 1.86+0.34* 1.68+0.21# 1.92+0.34#** 2.50+0.45##**A 6 0.86+0.24 0.78+0.13 0.86+0.13 0.78+0.12 0.92+0.37低密度脂蛋白（mmol/L）B 12 0.85+0.40 1.02+0.13* 0.98+0.21 1.23+0.40* 1.34+0.33* C 12 0.95+0.33 0.55+0.11##* 0.78+0.14# 0.89+0.17# 0.75+0.12# D 12 1.02+0.32 0.66+0.12# 0.86+0.24 0.75+0.13# 0.76+0.12##* A 6 0.87+0.31 0.86+0.21 0.79+0.45 0.67+0.15 0.98+0.23△高密度脂蛋白（mmol/L）B 12 0.98+0.21 0.67+0.31* 0.65+0.14 0.55+0.14* 0.50+0.26**C 12 1.02+0.20 0.77+0.31 0.65+0.24 0.80+0.21# 0.79+0.12##D 12 0.96+0.12 0.60+0.23* 0.79+0.12# 0.78+0.34# 0.95+0.25##△
注: 1.A： 空白组，B：对照组（单纯激素组），C：实验组（5mg普拉固组），D：实验组（10mg普拉固组）。
2. 与A组比较， *P<0.05，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05, ## P<0.01。
与C 组比较，△P<0.05
表2：各组实验前后血粘度比较（x±s）
检测项目 组别 n 实验前 第8周 第10周 第12周 第14周
A 6 6.02+0.88 6.04+0.54 5.98+0.56 7.01+0.85 7.02+0.36血低切粘度（mPa.s）|10(1/s) B 12 5.87+0.54 8.36+0.35 * 7.05+0.41* 9.32+0.15* 9.89+0.21* C 12 6.84+0.25 7.35+0.34 6.57+0.36 8.21+0.26 7.45+0.34#D 12 6.29+0.84 5.35+0.45#△ 4.89+0.42* 4.90+0.51##* 6.21+0.24* A 6 3.72+0.32 3.69+0.35 3.58+0.25 3.54+0.21 3.41+0.14血中切粘度（mPa.s）|50(1/s) B 12 3.97+0.32 3.99+0.25 3.85+0.32 4.20+0.33 4.80+0.51* C 12 4.07+0.52 4.70+0.12 4.55+0.24 5.20+0.47*# 5.11+0.24 D 12 3.52+0.36 3.56+0.44 3.29+0.24 3.52+0.12#△ 4.69+0.52*A 6 3.18+0.31 3.24+0.12 3.50+0.21 3.42+0.15 3.51+0.18血高切粘度（mPa.s）|150(1/s)B 12 3.08+0.21 3.12+0.15 5.27+0.21* 5.36+0.16* 5.03+0.17*C 12 3.54+0.32 3.19+0.32 3.52+0.14## 3.47+0.13# 4.02+0.56D 12 3.56+0.17 2.72+0.14 3.05+0.41 3.20+0.35# 3.44+0.28#△
注: 1.A： 空白组，B：对照组（单纯激素组），C：实验组（5mg普拉固组），D：实验组（10mg普拉固组）。
2. 与A组比较， *P<0.05，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05, ## P<0.01。
与C 组比较，△P<0.05
表3 各组实验前后血红细胞压积（HCT），红细胞聚集数比较（ ± ）

检测项目 组别 n 实验前 第6周 第8周 第10周 第12周
A 6 1.89+0.13 1.72+0.12 1.66+0.08 1.50+0.20 1.40+0.13红细胞聚集数 B 12 1.94+0.22 1.97+0.30 2.13+0.17* 2.35+0.24** 2.56+0.36** C 12 2.06+0.33 2.06+0.31# 2.65+0.12## 2.87+0.47# 2.75+0.36 D 12 1.51+0.31 1.90+0.48 1.85+0.26# 1.67+0.4## △ 1.69+0.24#△ A 6 35.45+4.13 33.25+5.21 33.40+4.01 32.14+5.20 31.44+4.23红细胞压积（%） B 12 36.24+2.51 34.31+4.27 40.24+3.08** 39.47+4.11* 36.98+5.01* C 12 38.21+3.08 35.14+4.36 37.45+5.11# 35.28+3.71# 34.18+2.02 D 12 37.47+3.78 34.21+2.14 33.13+4.87## 34.21+5.4#1 37.12+4.13
注: 1.A： 空白组，B：对照组（单纯激素组），C：实验组（5mg普拉固组），D：实验组（10mg普拉固组）。
2. 与A组比较， *P<0.05，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05, ## P<0.01。
与C 组比较，△P<0.05
3.实验前后PT及t-PA变化：
实验前后同期Pt及 t-PA对照组较空白组显著降低(P<0.05)，实验组较对照组也显著降低(P<0.05)，虽较空白组有升高，但无显著差异(P>0.05) 。C,D 组间则无明显差异 ，如表4 。
表4 实验前后PT, t-PA变化（ ± ）
组别 n(只)  PT（秒）    t-PA（u/L）
  实验前 实验后(12w)    实验前 实验后(12w)
A 6 15..01±2.31 14.89±3.02 1.45±0.35 1.42±0.25B 12 15.11±2.30 8.34±2.28* 1.32±0.24 0.73±1.20*C 12 14.13±2.54 12.32±3.10## 1.45±0.21 0.92±3.12#D 12 14.58±3.24 13.48±2.56## 1.26±0.33 1.29±1.04 ##
注: 1.A： 空白组，B：对照组（单纯激素组），C：实验组（5mg普拉固组），D：实验组（10mg普拉固组）。
2. 与A组比较， *P<0.05，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05, ## P<0.01。
与C 组比较，△P<0.05

4. 股骨头x线变化
对照组（B组）示在兔使用DEX 6周后双侧股骨头区骨质疏松，皮质薄，可见软骨下区非对称，不规则透亮区，骨小梁模糊，密度增高（周围骨密度相对减低），致12周可出现不同程度软骨面塌陷，透亮区周围 硬化带形成，关节间隙变窄，甚至骨性关节炎表现。实验组（C、D组）从实验后8周起均可见不同程度骨质疏松，可见不明显少许点状透亮影，未发现明显硬化带形成及软骨面、关节间隙形态学上改变。（见图3、4）
4. 股骨头组织病理变化：
4．1大体标本所见：
所取各组各期股骨头均完整，10周前各组所取标本于表面均未见明显改变。10周后所取对照组（B）股骨头可见表面已失去光滑表现，可见隐约的软骨下塌陷的小凹痕。而C,D两组则仍然光滑。沿冠状面切开时，同期所取标本中以B组所遇阻力最小，A组最大，C,D组介于两者之间。（见图5、6）
4．2光镜观察：
对照组第6周骨小梁处、软骨陷窝空泡增多，呈灶状分布，骨髓基质脂肪转化率高，骨髓出现较严重变性，溶解，渗出。6周后出现骨细胞坏死，表现为核固缩，核溶解，及破裂。骨陷窝空泡程度加重，平均空虚率达（45.1±10.2%），同时软骨下骨板菲薄，连续性中断，骨髓区变化主要为大片髓组织变性、溶解、坏死程度加重，髓内血管受压，部分变性坏死，管腔变窄，内可见脂肪栓子及血栓形成。髓腔内可见轻度纤维化及轻度的炎性反应。至14周在骨坏死区存在不等的新骨形成，实验组于第6周至第12周，观察骨小梁处、软骨陷窝空泡无明显变化，软骨下区骨板连续，未见明显大片骨坏死，平均空虚率为（23.12±3.2%）基质细胞脂肪转化率降低，髓腔内血管走行正常，未见明显血栓，及脂肪栓塞形成，髓腔内基质细胞转化脂肪率下降。（见图7～12）
4．3透射电子显微镜：
电镜下观察我们发现各期空白组（A）骨基质排列整齐，密度均匀，骨细胞分布均匀，大小与陷窝一致。细胞形态大小均呈卵圆型，细胞周围伸出细小微绒毛进入基质中，核浆比例约为1：1。胞浆中对照组动物从第6周起骨基质排列稀疏，钙盐沉积变少，呈骨质疏松改变，基质中空泡陷窝增多，如光镜所见，部分骨细胞皱缩变形，胞浆中吞饮有脂肪小滴，胞浆与胞核之间出现一透亮带（胞浆水肿），超微结构上主要表现为粗面内质网浓缩，胞浆胞核内染色质异常浓聚，线粒体嵴变短，部分短裂。第8周后出现细胞凋亡表现：核膜逐渐溶解，核固缩，核溶解，形状与骨陷窝不一致。胞浆内部分细胞器（Golgi体，内质网）被胞膜所吞噬，线粒体并有超浓聚现象。骨髓组织可见髓内脂肪细胞沉积，血管受压变窄。到后期程度更重，与光镜所见一致。而实验组中骨基质仍可见众多胶原纤维形成及大量钙盐沉积，骨细胞形态大致正常，基本呈卵圆形，陷窝形状与骨细胞一致。细胞器及胞浆，胞核在各期均未见明显改变，表现与空白组类似。（见图15、16）
5  细胞凋亡检测：
在对照组中，相对于正常组，于光学显微镜10 40倍的视野下，除观察到如上述光镜所见情况外，还可见众多凋亡小体形成。其形成机制主要为凋亡细胞中的细胞器及胞浆、胞核降解，被胞膜分离包绕，形成浓聚性小体，散落于基质中，部分被破骨细胞吞噬。其凋亡指数（Apoptosis Index）随时间的延长而增大，从6周时的 20.24 9.31到渐增至8周后的44.12 13.10，而实验组中AI变化各时间段内无明显差异,且较对照组相应值比较有显著差异。（如表5，见图1、13、14）
5 各组实验前后AI结果比较（ ± ）
组别 n 实验前 第6周 第8周 第10周 第12周
A组  6 10.10±3.45 10.23±5.01 11.04±4.17 9.56±4.12 10.14±3.69B组 12 11.04±4.01 20.24±9.31** 24.11±10.14** 32.15±10.75** 40.36±11.12** C组 12 10.56±4.13 13.13±5.32* 18.24±7.11#** 14.25±8.10 #* 15.54±5.65 #** D组 12 11.25±5.45 10.36±4.56 ## 16.16±5.69 #* 12.04±5.58 #△ 15.24±4.73 #*
注: 1.A： 空白组，B：对照组（单纯激素组），C：实验组（5mg普拉固组），D：实验组（10mg普拉固组）。
2. 与A组比较， *P<0.05，**P<0.01；与B组比较，#P<0.05, ## P<0.01。
与C 组比较，△P<0.05

讨 论
1.激素性股骨头坏死动物模型的建立及普拉固对成模过程的影响
1.1造模动物的选择
自20世纪70年代以来，学者们就开始设想使用不同的动物来复制出激素性股骨头坏死模型。因为兔的经济性及易操作性等特点故成为造模的首选，而Wang (5)王坤正(5)等也成功的利用兔造模成功，但前期造模中，结果显示并非每只兔子都能成功，这可能与激素用量，应用时间，兔子种群及对激素的耐受程度等因素有关，故又有人提出使用鸡(7)，鼠，羊，犬(8)等，其中各有优缺点，其中鸡的优点可以是（1）双下肢负重，与人直立行走是双下肢负重的生物力学特性是一致的，故其坏死的进程应也与人类相似。（2）鸡多为高脂肪饲料喂养，血脂基础浓度高，在激素的联合作用下易造成高脂血症，高粘质血症，从而易导致股骨头血管脂肪栓塞血栓形成，微循环障碍，股骨头缺血，死亡。（3）鸡来源方便，经济，死亡率低。其缺点也是明显的：与人类亲源性较远，鸡股骨头血液循环系统尚缺乏深入了解，激素对其作用机制不详，鸡各器官较小，血管纤细，难以取材。其余动物均存在上述相类似的问题，造模均有其利弊两方面。经长期研究后，贺西京等(4)成功提出比较标准的动物模型，造模成功率高，经济实用。故选择此种模型作为本次实验的造模方法。
1.2激素使用方法，剂量
于90年代中期，Wang（5）等给家兔肌注甲基强的松龙，每周2.7mg/kg，4周后造模成功。王坤正等（6）予兔皮下注射醋酸氢化可的松，每周 8mg/kg,4周后造模成功。刘培林（7）等认为地塞米松应用广泛，血中白蛋白结合的部分较少，生物活性大，其半衰期较甲基强的松，甲基氢化可的松长、经济、，使用方便，所以更适合作为造模药物。此次实验中我们根据贺西京及周强等（9）造模所采用的方法：地塞米松注射液, 2.5mg·kg-1·d-1，im，4周后股骨头出现坏死灶。
1.3模型是否成功的判定及评价标准及普拉固对成模过程的影响
1.3.1一般情况：
是否出现库欣氏综合征，即皮质醇增多症的表现，如精神萎靡，毛色及皮肤失去正常光泽，向心性肥胖，肌肉萎缩，机体免疫力下降，易感染，性功能障碍。另外如出现股骨头坏死可表现为，下肢运动明显受限，跛行。实验组中可观察到从第4周起纯激素组中全部均陆续出现上述的一般表现，自8周后陆续有5只出现跛行步态。实验组中仅有2只因兔癞和上感死亡，但未出现跛行。
1.3.2 X-ray检查：
成功造模者往往显示股骨头周围出现骨质稀疏，骨皮质变薄，骨小梁模糊不清或消失，股骨头软骨下区可出现散在低密度区的表现。随着病程的进展，还可出现坏死灶扩展后形成的透亮区，及其周围出现硬化带，到晚期可出现股骨头面及髋臼面的不平及毛糙，关节腔狭窄等。本次实验中Group B自第6周出现了上述部分改变，且随时间延长，其表现趋于典型。12w时已出现了右髋的髋臼形态改变，考虑骨性关节炎的开始。而实验组变化则与空白组（正常组）之间无明显差异。
1.3.3 大体观及组织形态学检查：
已造成股骨头坏死的模型股骨头松脆，易于剖开凿切。贺西京（6）于光镜下观察了激素性股骨头坏死组织，发现从第4周开始，软骨下区骨小梁部分骨细胞核固缩，胞核较小，染色深，骨髓内脂肪细胞逐渐增多，空缺骨陷窝数增多，至14周可达可达25%。我们在实验中观察到对照组自第6周起出现骨质松脆，易于从冠状面凿开，随着时间延长，其硬度愈差，冠状面示骨小梁稀疏，骨质疏松，小梁间可见众多脂肪溶解后所余的空泡，大量中型粒，嗜酸粒细胞等炎性细胞浸润，及髓腔内可见大量脂肪堆积，其堆积程度大小与时间正相关。骨细胞陷窝空虚率为（45.1±10.2%）至12周后的(70.13±10.6%),而实验组则分别为（20.12±5.1%）及(23.12±3.2%)。两组之间有显著性差异（P<0.05）。TEM下观察到较多骨细胞发生核固缩及骨细胞破裂成碎片，出现了骨细胞的坏死，骨小梁形态无明显变化，其排列已较稀疏，钙盐沉积变少。由于Ficat 等认为骨小梁骨细胞陷窝空虚率>50%，为骨小梁坏死。故在本次实验中，认为对照组中自6周后就可以有骨小梁坏死出现，分期考虑进入Ⅱ期以上。随着时间的延长，以后逐渐进入3，4期。 同志勤（10）等在SEM（扫描电子显微镜）下观察造模坏死股骨头骨小梁表面有许多卵圆破骨细胞形吸收陷窝，部分骨小梁表面附着许多球蛋白样结构的物质。在TEM下可见骨细胞染色质浓缩，核体积小，胞浆内质网、线粒体、Glogi体肿胀或固缩等慢性缺血性坏死的表现。由于出现骨和骨髓死亡的组织学证据是确诊骨坏死的标志，所以该指标已成为造模成功与否的金标准。在实验中，我们发现而于电镜下 表现为激素促进骨细胞器及细胞核，骨基质退变，超微结构示线粒体超浓缩，Golgi体消失，可见众多吞噬了凋亡小体破骨细胞（巨噬细胞）形成 ，同时还可以看见细胞器（内质网，Golgi体炎性水肿），细胞凋亡分析也发现众多炎性细胞的浸润于发生变性的骨细胞周围、这意味着细胞发生凋亡的同时，坏死也在进行，两者的同时出现加剧了SIFHN的发展进程。而实验组中则少见此类现象。大小剂量组之间差异不大。
1.3.4 其他检查
除上述可作为定性的影像学，病理检查，如何对其进行定量后分型分期仍是目前的讨论热点，如因为SIFHN可以造成骨组织基质退变加速，生成减慢，通过对骨组织主要构成：1胶原纤维成分羟脯氨酸（Hop）,2.粘多糖主要成分氨基己糖（HOM）的测定（11）来对SIFHN进行骨组织成分流失的定量分析。已采用的方法还有股骨头血管造影（12）及骨内压测定（13）但应其创伤性及因测试点不同而导致的假阳性，假阴性出现导致上述方法的难以推广。而目前还有一些检测项目正在推广中，值得推荐的是核磁共振（MRI）检查：其主要是能针对轻微症状的Ficat分期 期以前的SIFHN进行筛查，以利于该病早期诊断及防治，MRI 主要表现为T1加权或（和）T2加权中，股骨头局限坏死区和正常骨质之间可见线样低信号改变，此即称为线样征。在T2加权中于线样低信号带的内侧可见一高信号的线影，此即称之为双线征的特征性的改变（14）上述变化于病变早期（0期）即可以出现，故对早期诊断SIFHN十分有意义。本实验中因考虑众多如MRI需测试对象暂时静卧，兔子不易依从，及经济因素等未予开展，也是今后研究SIFHN防治的方向之一。
1.4实验中的非特异性指标
我们知道，在SIFHN 中，大量长期的激素使用造成体内脂肪代谢紊乱，形成高脂血症（15），以及高粘质血症（16），血栓前高凝状态（17），故对血脂，血粘度及作为血栓前状态之相关因子t-PA的测量可从一方面反映SIFHN的严重程度，同时还测量了PT等，则反映了SIFHN的最终的血凝状态。本实验中实验前后同期Pt及 t-PA对照组较空白组显著降低(P<0.05)，实验组较对照组也显著降低(P<0.05)，虽较空白组有升高，但无显著差异(P>0.05) 。C,D 组间则无明显差异 ，说明药物组对降低血凝，血粘有确切效用，可以控制血栓前高凝状态。

2．普拉固对SIFHN的干预作用
2.1本实验研究结果显示普拉固组中小剂量组及大剂量组的兔血脂，血黏度较激素组均升高（P<005）。Pt, t-PA较激素组降低（P<0.05），其X-ray 示股骨头及髋臼可见软骨下区不规则骨折及新生骨形成带明显减少，HE染色示骨质无疏松表现，骨陷窝空虚率，髓内基质细胞脂肪转化率减低，髓内血管栓子形成减少。透射电镜示骨细胞内脂滴减少。细胞凋亡分析示实验组凋亡小体少见，骨细胞凋亡指数较对照组减少。但普拉固这种对SIFHN的干预作用，大小剂量间不存在显著差异。
2.2 健康动物使用激素后出现了股骨头坏死，说明皮质激素是股骨头坏死的一个较肯定因素。长期大量使用激素可以全身多个脏器产生影响，也可诱导骨细胞直接死亡，即骨坏死（18）。80年代初Moran等认为长期大量的激素应用可形成高脂血症，进入骨细胞体内脂质增多，并沉积细胞内，损伤骨细胞。高脂血症可导致股骨头血管脂肪栓塞；导致高粘质血症，血液高凝，低纤溶状态，及微血管炎症损伤，最后导致血栓形成，血供障碍；造成骨髓基质细胞的脂肪细胞分化肥大，骨内压升高，股骨头血供受阻。可使股骨头发生骨质疏松，发生软骨下骨折、塌陷、股骨头坏死。
2.3 普拉固能有效干预SIFHN的进程。普拉固是3羟3甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，他竞争抑制HMG-CoA还原酶，具有降胆固醇，甘油三酯，及低密度脂蛋白（LDL）的作用，同时还有调脂以外的作用。本实验结果提示主要通过降低血脂，血粘度，及抗凝作用，防止骨细胞脂肪变性坏死及所致的骨内压升高，脂肪栓子形成导致的脂肪栓塞。促进及恢复股骨头血供，保护微血管，改善骨质疏松，促进骨重建。
3. 普拉固降血脂对SIFHN的干预作用：
脂肪栓塞学说中大量的动物实验证明动物用了大剂量的肾上腺糖皮质激素4周后便形成高脂血症及脂肪肝，因此引发了股骨头一系列的病理变化，在股骨头微循环的改变方面 有以下原因：脂肪血栓形成，多数作者认为脂肪肝多合并高脂血症，此时血中脂地易附着于终末动脉管壁上，由于血流的压力，使脂滴变形，压缩而嵌入更细小的动脉壁上。由于骨内血管通道容积恒定，血管舒缩性受骨组织的限制而失去代偿功能，导致这些血管阻塞，相应供血区骨组织缺血和坏死（19）。：
骨细胞脂肪变性坏死学说认为使用长期大量皮质激素后，股骨头内骨细胞胞质会出现脂质沉积，随着激素应用时间的延长，脂质沉积物逐渐增多并融合成脂肪滴，Kawai 认为脂滴是是甘油三酯。多个脂滴会融合成更大的脂滴，引起骨细胞内的占位性病变。出现细胞受压，边聚，细胞器功能受干扰，进而引起核固缩，裂解，致死亡（20～22）
COA还原酶是体内胆固醇合成过程中早期的限速酶，他汀类药物普拉固属于HMG-COA还原酶抑制剂，对它有特异的竞争性抑制作用，从而抑制肝内胆固醇合成，同时使低密度脂蛋白（LDL）受体数量上调，活性增强，加速极低密度脂蛋白（VLDL）残粒及LDL清除，另外，还抑制细胞胆固醇合成，干扰脂蛋白生成，从而使血清胆固醇水平下降。从而达到干预上述病理变化的作用。在本实验实验组中普拉固能明显降低外周血脂浓度，于对照组存在显著差异（P<0.05），同时在大体观及组织形态学检查中发现髓腔中脂肪堆积程度减少，髓内血管受压及栓塞均减少，股骨头病变程度明显减轻。

4．普拉固降血粘度对SIFHN的干预作用：
Alert认为激素使血液呈高粘滞状态，血液的凝固性增高，静脉栓塞，血液淤滞，在骨硬壳带内形成骨内高压（23）。付志厚（24）等对41例股骨头坏死患者的实验室检查结果显示血小板粘附增高率达87.1%，血小板聚集率明显提高，证明了SIFHN的发生与血液的变化是密切相关的。李喜东（25）等在实验中发现，随激素使用时间延长，小静脉和毛细血管呈泥沙状流动，可见红细胞聚集现象，血粘度随之增高。认为激素可以使血中纤维蛋白原的含量升高，由于纤维蛋白原在血液中形成网状结构，加之红细胞聚集，使血粘度增加，并刺激血小板大量生成，凝血能力增强，微循环灌注量的下降，导致股骨头坏死的发生。
在高脂血症的病人中，普拉固可以全血及血浆粘度降低（26），抑制血小板凝聚，降低血浆纤溶酶原水平，组织型纤维蛋白蛋白原激活物活性升高，组织型纤维蛋白溶酶原激活物/纤维蛋白溶酶原激活物抑制物(t-PA/PAI)比值升高，纤溶活力提高，恢复到正常（27）本组实验对照组中血粘度较空白组明显升高，部分甚至P<0.01,实验组中则表现为少许升高，但与对照组比较，仍有显著差异。

5.普拉固抗高凝对SIFHN的干预作用
在生理状况下，机体的凝血和抗凝血，纤溶和抗纤溶保持着动态平衡。当这些平衡被打破并朝着凝血方向进行时，便会促成血栓前状态甚至血栓形成。有研究表明，t-PA的减少和PAI的增加是血栓形成的重要因素。研究表明（24）高胆固醇血症患者常伴有血小板依赖性凝血酶增多，呈高凝状态,由于动物同时存在易栓症和纤溶活性下降，不能充分溶解股骨头内的血栓而发生静脉栓塞，循环受损，导致骨内高压，进而发展为骨坏死。（28）
普拉固治疗可以使胆固醇水平降低的同时，也使凝血酶趋于正常。研究还发现（26），有组织因子及相应的mRNA存在于人类动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中，在培养的人类巨噬细胞中，普拉固与组织因子生物合成有关的garanylgeranylated蛋白质，抑制组织因子表达，从而抑制外源性凝血系统的启动。此外，纤溶酶原激活物抑制物-I（PAI）是纤溶系统的主要抑制物，而血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)则是纤溶系统的激活物，前者的及后者升高是同步的，都意味着血易高凝，血栓易形成。而在SIFHN真正患者中都可以发现上述变化，提示其纤溶系统功能受限，血液处于高凝状态，且形成的血栓不易溶解脱落，势必加重股骨头血供障碍。Danges（29）报道而普拉固治疗高危人群3个月后则可发现PAI下降15%～18%，显著减少了血栓的形成。在本次实验中我们发现对照组中实验后PT,t-PA均下降，较实验前有明显差异，（P<0.05）,提示该组兔子经长期大剂量激素处理后血液已呈高凝状态。而实验组中指标与对照组比较有明显差异。和空白组无明显差异，提示血凝功能接近正常。大小剂量用量组间无显著差异。

6.普拉固与SIFHN中细胞凋亡的关系的探讨
细胞凋亡是指在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞“自杀”现象。细胞凋亡的机制尚未完全阐明，细胞凋亡由病理刺激或生理刺激引起，是主动性细胞死亡，其过程由基因调控。目前认为其基本过程是细胞在凋亡信号刺激下，通过信号传递通路，使凋亡调控基因表达发生改变，进而在某些离子如Ca2+和Mg2+参与下激活某些酶而启动细胞凋亡。如核酸内切酶使DNA在核小体联结子部位断裂，钙蛋白酶破坏细胞骨架而使细胞皱缩，谷酰胺转移酶使胞浆内蛋白质交联。细胞凋亡的基因调控十分复杂［30］，目前已知主要的促凋亡基因有Bax、wp53、APO-1/Fas等，主要的抗凋亡基因有Bcl-2、mp53、ras、Bcr/Abl等，而c-myc则具有促进细胞增殖及诱导细胞凋亡的双重作用。当有血清、生长因子和丝裂原等存活因子存在时，c-myc促进增殖，反之则诱导凋亡。各基因间还存在正、负调节和相互作用，糖皮质激素作为促凋亡因素可以促进细胞凋亡［31］有研究发现皮质激素有促进成骨细胞和骨细胞凋亡的作用，是导致SIFHN发生的重要因素[32]。实验中所见主要表现为受累成骨细胞和骨细胞呈散在、单个发生，细胞核固缩，染色质密度增高并聚集在核膜周边细胞浆固缩，胞膜内陷将细胞分割为多个外有膜包裹、内有完整细胞器的小体，即凋亡小体(Apoptotic bodies)。多数小体含有核成分，凋亡小体被临近的巨噬细胞或组织细胞吞噬，无细胞膜溶解、线粒体和溶酶体破坏和酶漏出，不出现炎症反应。本实验出现了对照组较空白组碉亡指数明显增多（P<0.05）,而实验组较凋亡组明显减少（P<0.05），说明长期大剂量激素的使用促进了骨或成骨细胞的凋亡，而普拉固则对这一进程有干预抑制作用。但值得注意的是结合在光镜下表现普拉固在抑制凋亡的同时，也抑制了骨细胞的坏死。但因各种局限性本次实验无法从分子生物学水平上探讨激素对其凋亡调控基因水平上的影响，可作为今后对SINFHN机制进行深入研究的新方向。
总之，普拉固作为临床的一线降脂药已使用多年，近几年又陆续发现了其在非调脂以外的一些作用，为临床防治SIFHN带来了新希望，我们通过本实验能证实其在SIFHN的动物造模中起到确实的干预作用，为今后在实际工作中大规模开展临床药理实验提供了实验理论基础。也为今后开展防治SIFHN的工作提供了有效借鉴。
结 论
1．  在本动物实验条件下，普拉固可以通过直接降血脂，血粘度，抗血凝，减少骨质疏松，从而可以减少股骨头微血管内脂肪栓及血栓的形成，减低软骨下骨折塌陷的机率，防止骨内压过高致血供受限。达到预防SIFHN目的。
2．  激素在引起股骨头骨细胞坏死的同时，也加速了它的凋亡，而普拉固可以 明显抑制这两个进程。
3. 普拉固大剂量（10mg）小剂量(5mg)在干预SIFHN进程方面效用无显著差异。
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