【讨论】再谈免疫组织化学Triton X-100破膜和二抗封闭原理问题

最近一直关注免疫荧光，几个问题问一下：
第一：triton X-100 破膜的原理到底是什么，我以前看过的资料是它是个脂溶性的东东，可以溶解细胞膜和核膜的脂质，从而形成孔洞，让抗体进入，所以有人说triton x-100又叫打孔剂。一般用0.3%的浓度，PBS稀释。
但是总有人问我，如果是膜蛋白染色，破不破膜？
如果是膜蛋白，要看抗体和抗原的结合位点，如果是跨膜蛋白的话，其结合位点在胞内段的话肯定是需要破膜的。
根据上面的理解，破膜并不会对蛋白造成影响，只是溶解了脂质形成“孔”。
所以我觉得如果条件允许，常规每次都破一下，还是很好的选择。
你的理解是什么呢？
第二：二抗封闭原理的问题。
上一抗之前都要用二抗来源的血清封闭，那么封闭的原理到底是什么。
看资料说是封闭样品中能够与二抗发生非特异性结合位点，降低非特异性显色。用的封闭液是二抗来源的血清。
我的理解：二抗也是抗体，通常用的是说是和一抗的fc端特异性结合的IgG。
如果是减少非特异性结合的话，那么应该是二抗能够跟样品中的某些东西反应，而二抗来源的血清能先进行阻断。
我的问题是：样品中到底是什么物质，可以和 二抗来源的血清中的什么物质，进行结合从而阻断。（即样品中，和二抗来源的血清中，分别是两种什么物质发挥作用）；
但是一个新的问题产生了，大家一般多用的是BSA封闭，BSA叫做牛血清白蛋白，他是如何起到封闭作用的呢？
第三：最近做免疫荧光，一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。
本来我怀疑是抗原弥散了，但是细胞是固定过了的啊，而且同样的方法染色另外一个胞浆表达的抗体，就没有这个问题。
白死不得其解，快要愁死了。
谢谢，请大家指导！
@wh2008
@byd123
@skyskytotop
@甲醛
@多聚甲醛