【求助】GST标签蛋白纯化和western blot 疑问...............

qishuai231

发布于 2013-11-27 · 浏览 1705 · IP 吉林吉林

1、2泳道为蛋白液孵育离心后，用Wash Buffer洗涤两次后的液体，还有两次没有电泳，因为泳道不够；
3泳道为洗一次Elution Buffer洗脱液，但是电泳前没有经过煮沸处理；
4、5、6、7、8泳道为第一、二、三、四、五次用Elution Buffer洗脱液。
所有获得的蛋白取100ul ，加入5 x SDS电泳缓冲液25ul（含有β-巯基乙醇），然后沸水浴15min，取20ul上样电泳。
所有流出液均是通过700g 2min离心所得；
结果如下:

用Wash Buffer洗涤了两次；未使用离心的方法，都是通过自动流下所得；所有获得的蛋白取100ul ，加入5 x SDS电泳缓冲液25ul（含有β-巯基乙醇），然后沸水浴15min，取20ul上样电泳。

大家能不能帮我分析一下，这些杂带是怎么产生的，有什么方法可以减少或者消除这些杂蛋白。
另外我想知道，做Western Blot实验的话，是不是蛋白不能变性，那样的话，β-巯基乙醇和将蛋白煮沸是不是都不能这样做了。
还有就是，我的这个蛋白esat6只有6KD，但理论上是9KD，那么和GST融合表达之后怎么计算的了。如果单独用目的蛋白做WB实验的话，免疫原性是不是不好；那要是和GST标签一起来做WB实验的话，会不会干扰。再者，我的WB实验中是用小鼠血清做为一抗，如果杂蛋白是GST的会不会使杂带显色，换句话说就是小鼠血清中是不是存在GST抗体。
问题有点多，表达这个蛋白耗费了我和长时间才做到这一步，本人菜鸟，希望能得到大神的指点，提前感谢你们！