流感病毒方面的综述

翻译的一篇综述（CD4T cell responses to influenza infection），原文在附件里。

CD4T细胞在流行性感冒感染免疫应答中的作用

摘要
病毒感染的免疫应答包括一个在初始信号和对特异T、B淋巴细胞的适应性应答之间的复杂的完美的结合。抗病毒CD4细胞不但能通过分泌一种1型细胞因子，包括IFN-γ和TNF-α，来激发CD8应答，还能使B细胞产生IgG2a来中和感染的病毒颗粒。本篇综述主要论述了CD4细胞在机体对流行性感冒（一种急性的局部呼吸道感染）的免疫应答中的作用。我们考虑CD4细胞在抗流感保护中起到重要作用可能归功于免疫病理和产生功能性的不同的记忆性成分。
关键词
CD4T细胞；流行性感冒；IFN-γ；记忆性T细胞；细胞毒性
1.序言
基于CD4T淋巴细胞产生的细胞因子可把它们分成两组，在IL-12和IFN-γ存在时，遇到抗原后初始CD4细胞能分化成Th1细胞，一种以产生IFN-γ,IL-2和TNF-α为特征的细胞。另外，在IL-4存在时，抗原信号诱导初始CD4细胞群分化为Th2效应细胞来分泌IL-4,IL-5和IL-13。Th2相关的应答例子包括胞外的寄生菌感染，如血吸虫、日本圆线虫和过敏性疾病。众所周知病毒感染主要引起Th1或1型免疫，即提升CD8细胞的活化、巨嗜细胞的功能和使B细胞分化。1型应答也和一些自身免疫性疾病相关，是有效的抗肿瘤免疫应答的标志。理解CD4细胞在不同的免疫应答中的作用首要的是设计针对恶性及自身免疫疾病的有效治疗，及生产更好的疫苗来提升对感染的细胞介导的免疫。本篇综述将主要集中在CD4细胞在局部的呼吸道感染流感中的重要性。特别要强调的是给出了CD4对流感的肺部感染的应答和对系统性、持续的感染如LCMV和丙型疱疹病毒的应答的比较。
引起病毒感染免疫应答的几个因素包括：病原体自身的性质，感染途径，是慢性持续性或急性感染及病毒是如何被提呈给适应性免疫应答的特异性T细胞的。病毒在胞内寄生，用宿主细胞的转录和翻译系统进行复制。甲型流感病毒和副流感仙台病毒都是负链RNA病毒，在病毒生活周期的细胞溶解阶段，复制被限制在呼吸道的上皮内进行，这就导致了组织破坏。相反，LCMV是一种被认为没有细胞溶解的RNA病毒，能在不引起宿主大的损伤的情况下进行复制。经尾静脉注射LCMV来感染小鼠，可引起伴有脾脏和肝脏高病毒效价的系统性感染，而感染最终要通过宿主的免疫应答来解决。在宿主的免疫应答降低时，LCMV感染变的更持久，并伴有高病毒效价，但组织破坏很小。最后，象疱疹病毒（EBV）和逆转录病毒（HIV）都是细胞病变性病毒，在初期引起溶细胞感染，随后是一潜伏的持续的感染。
2.流感的适应性免疫应答的复杂性
流感病毒经鼻感染气道的上皮细胞并局限于呼吸道。用亚致死剂量的病毒感染后引起急性感染，是因为小鼠组织了强大的免疫应答，限制了病毒的扩散并在7到10天内从肺内完全清除病毒。细胞毒性的CD8细胞靠依赖1型的细胞毒机制，包括穿孔素和Fas，在清除肺内流感病毒的过程中发挥了重要作用。早期的研究应用缺乏1类分子的小鼠，这种小鼠缺乏CD8细胞，研究发现在清除呼吸道的HK31流感病毒是延迟的。在用高致病性流感菌株（PR8）感染小鼠后，CD8细胞的缺乏导致病毒复制和最终发病率的增加。后来的结果显示CD8细胞在病毒清除中是绝对需要的。
B细胞和中和抗体在对流感的免疫中起到了重要作用也被证实。缺乏B细胞的μMT小鼠通过CTL应答能清除HK31流感。然而， μMT小鼠清除PR8流感是失败的，这就导致和对照的野生型相比发病率增加。因此，相对于于CD8细胞，B细胞在清除流感中是相对需要的，这可能依赖于不同品系流感菌株的致病性和毒性。
3.CD4细胞在抗病毒应答中的需要
为了研究CD4细胞在病毒的清除中是否绝对需要，早期的研究用了CD4的衰竭抗体或Ⅱ类分子靶基因缺陷的小鼠。在抗CD4抗体治疗的小鼠，CTL前体细胞频率在淋巴结和BAL对HK31感染的应答中没有区别。另外，缺乏MHCⅡ类分子及因此缺乏CD4细胞的小鼠和野生型对照小鼠相比，在清除肺内的病毒上只有轻微的延迟。在另一报告中，前体CTL细胞在Ⅱ类分子缺乏的小鼠低于对照的野生型，然而，在抗病毒应答中CTL溶细胞能力的峰值在CD4缺乏和野生型小鼠间是一样的。这应该引起注意，即如同IL-4和IL-5一样，IL-2和IFN-γ在缺乏CD4小鼠的淋巴结和BAL中大量减少，这就显示了CD4细胞在感染免疫应答中是通过分泌细胞因子发挥作用的。
CD4细胞缺乏的小鼠能有效清除PR8病毒，这就暗示CD4细胞在清除致病力强的流感菌株时不是必需的。然而，当B细胞和Th细胞缺乏时，CD4细胞在流感免疫应答中的作用就变的明显了。μMT小鼠用抗CD4的衰竭抗体治疗后不能清除PR8病毒，并对此病毒株显示出高死亡率，这就说明CD8细胞单独不能清除病毒，也暗示CD4细胞在协助维持CTL免疫应答中很重要。在一系列类似的实验中，用抗CD8的衰竭抗体治疗B细胞缺乏的小鼠后，仍存的CD4应答不能有效的清除病毒，小鼠死于HK31或PR8的亚致死剂量。这些数据暗示CD4细胞单独不能有效的清除病毒，说明CD4细胞抗病毒免疫中的重要作用可能是给抗体产生提供帮助。因此，细胞衰竭研究的结果显示CD4细胞对于给CD8和B细胞提供帮助来说可能仅仅是间接参与。
来自Gerhard的表1显示，对于一个致病力强的流感菌株来说，不论是CD8、CD4或B细胞都不能单独有效的清除病毒，小鼠死于亚致死剂量的病毒。然而，如果把这些细胞联合起来，小鼠能轻松的清除感染，存活率增加。因此，对于流感致病性菌株的免疫应答需要CTL、分泌Ab的B细胞和分泌细胞因子的CD4细胞之间复杂的相互作用。
CD4细胞的作用在对LCMV的CD8应答中也观察到了。在急性LCMV感染期，CD8毒性细胞是需要的，因为缺乏CD8细胞的小鼠不能有效的清除病毒。然而CD8应答的出现部分依赖于CD4细胞，因为CD4缺乏的小鼠病毒清除延迟，而且在随后的初次应答和二次应答中CTL的活性下降。更重要的是，在初次感染2个月后，Ⅱ类分子缺乏的小鼠复发感染时，CTL的活性和CD8记忆性应答也减弱。因此在局部和系统性感染的初次应答中，只要CD8和B细胞存在, CD4不是必需的。CD4细胞对于CD8毒性细胞应答的维持是重要的，同时，在急性局部感染如流感和系统性LCMV感染中发展到记忆阶段也是重要的。
4.应答的初始阶段：树突状细胞活化CD4辅助细胞
初始CD4细胞的活化除了协同刺激分子信号外，还需要经TCR的特异性抗原信号。在抗病毒免疫应答的准备阶段，可能是淋巴结和脾脏提供了空间组织和合适的化学因子环境，带来专职APCs和初始CD4细胞。DC在感染部位吞噬病毒颗粒，在对炎性信号的反应中成熟，迁移到淋巴结，并在Ⅱ类分子协同下提呈抗原肽活化初始特异性病毒CD4细胞。有文献证明表皮内有一可容纳未成熟DC即朗格罕细胞的网状结构，朗格罕细胞在多种炎性刺激物的应答中能快速迁移到淋巴结。最近认识到呼吸道有一类似网状结构来使DC定居，在特定条件下，DC可迁移到呼吸道的淋巴结。在流感感染后用CFSE鼻内给药，显示很高比例的CD11c+/CFSE+细胞积聚在淋巴结，在感染18小时后达高峰。有趣的是，DC积聚快速下降，而且这些细胞迁移到另一炎性刺激物的能力也减弱。这就说明，在对流感感染的应答中，DC迁移是暂时的，在DC迁移初始峰值后，是否其他类型的细胞迁移到淋巴结，这有待证明。另外，还不知道DC迁移在慢性感染中的作用，及对感染二次免疫应答的胜利是否由于短暂的自然的DC应答。
5.追踪抗病毒CD4应答：技术
尽管在急性病毒感染中，CD4细胞本身可能不起清除病毒的首要作用，但它们在维持CD8T细胞记忆和B细胞应答中的作用已在许多模型中被证实了。大多早期测定抗病毒CD4应答的研究用LDA和IFN-γ ELISPOT实验测试。流感相关CD4细胞出现频率用LDA测试，在脾脏中免疫应答高峰时大概是1/300。这项研究没有测试在肺和BAL中 的应答，在这些部位的感染是局限的，且很高数量的CD4细胞被补充过来。在一个相类似的呼吸道感染中，仙台病毒相关CD4细胞出现频率计算后发现和流感系统中获得的数据相等。同样，在LCMV系统性感染应答中，分泌IFN-γ的CD4细胞出现频率大约是1/200（对病毒感染目标），对优势的Ⅱ类分子肽是1/40。在所有感染的急性期后减轻的阶段，即记忆阶段，同样病毒CD4细胞出现频率在1/500到1/1000之间。相反，鼠γ－疱疹病毒感染的持续阶段，CD4细胞出现频率甚至在数月后仍保持高水平。
随着新技术的出现，直接用MHC1或Ⅱ类分子大量提呈抗原肽来追踪病毒特异性CD4和CD8细胞是可能的。用这些新技术，不用培养细胞及估计前体细胞出现频率就可测定CD4细胞应答的数量也是可能的。对LCMV的CD4应答是直接针对糖蛋白肽61－80的，这一点已基本证实，但针对这个抗原肽的相关细胞出现频率用LDA和ELISPOT测试时过低。用ELISPOT实验来测定GP61－80相关CD4细胞频率是1/40，而多聚体技术测试CD4应答是1/9。因此多聚体技术能发现在感染应答中扩增的细胞。然而在抗原相关细胞数量和最终分化的有能力分泌细胞因子的效应细胞之间是不等的。重要的是，这项技术可使我们观察到在特异病毒CD8和CD4应答之间扩增、减少等的区别。在LCMV和仙台病毒感染中，观察到CD8扩增大于CD4扩增。除了CD8之外，在不同阶段特异性病毒CD4都减少，在记忆库中发现的CD4细胞频率（1/500）远低于CD8细胞频率（1/12）。在我们的实验中用过继转移HA的TCRCD8和CD4细胞，结果发现在肺和BAL中CD8的数量超过了在感染部位的CD4细胞数量，这不计算转入的细胞。
现在有用多聚体技术检测的对LCMV，卵清蛋白，鸽子的细胞色素C和分枝杆菌抗原的CD4应答的很多数据，然而这些对定义流感中CD4的表位来说还不够。用PR8病毒感染BCLB/c小鼠，Gerhard及其同事已经鉴定出核蛋白、血凝素和神经氨酸酶蛋白的CD4细胞克隆。应用人造肽，PR8的血凝素蛋白可识别8个不同的表位，这些表位是已被T细胞克隆所识别的。来自这些克隆其中两个 的TCR已被用于繁殖TCR Tg小鼠，它们能识别HA110－120或HA126-138。在肽和佐剂存在 的情况下不能启动初次应答，CD4细胞的低频率和Ⅱ类分子对肽的低亲和力使初次应答的发现变得困难。
为了解决这些困难，我们的实验室采用了过继转移系统，来自TCR转基因小鼠的CD4细胞能识别被转移到不同BALB/c小鼠的PR8病毒感染的HA126-138。亚致死量感染后，用针对CD4，Thy1和多种表面标志的流式细胞技术可观察到CFSE标记的TCR TgCD4细胞。在感染应答中，由于初始CD4细胞数量少，其标志物不能用多聚体技术或IFN－γ ELISPOT观察到。
6.对流感的初次CD4应答
将特异HA　CD4TCRTg细胞过继转移入正常BALB/c小鼠，随后用亚致死剂量的PR8感染小鼠，数据显示在淋巴结，随后是脾脏出现了强劲的CD4T细胞应答，在感染后6－7天在肺和BAL达高峰。由淋巴结中 的CD4细胞产生的IL-2来控制应答，但在肺和BAL最终活化的CD4效应细胞只产生IFN－γ和TNF－α。在纵隔淋巴结中CD4T细胞开始增殖，且各个时期的细胞都能观察到。而在肺和BAL只有细胞完全分裂、分化为效应细胞才能发现。还不清楚强劲的初次CD4应答和CD4产生的IFN-γ如何在肺内进行保护，也不知道CD4如何在感染部位产生有记忆性的下一代，这些都是当前研究的热点。
7.CD4效应机制和保护
占优势地位的Th1应答通过分泌IFN-γ被识别，这就引起了对流感免疫应答中这种细胞因子的研究。敲除IFN－γ基因的小鼠感染后，证实2型细胞因子生成增加，同时特异性流感IgG抗体分泌增加。然而，在这些小鼠内的CTL应答和对照的野生型是可比的。有趣的是，从IFN－γ-/-小鼠分离出的CD4细胞克隆，在体外再次感染刺激后，经细胞毒机制可对抗致死剂量的流感病毒。这就说明病毒感染1类分子缺乏的小鼠后出现了能溶解仙台病毒或LCMV感染目标的CD4细胞，显示出了CD4细胞能通过转变为杀伤细胞来弥补CD8或IFN－γ的缺乏。在对流感免疫应答中细胞毒性CD4细胞的重要性还有争论，因为在用Ⅱ类分子缺乏的上皮细胞骨髓嵌合体证实CD4细胞不能直接识别感染的上皮而行使效应功能。相反，从野生型分离出CD4细胞克隆或IFN-v缺乏的小鼠能抵抗致死量流感病毒的感染，这不是依靠它们的细胞因子，而是它们溶解病毒感染目标的能力。
我们发现针对感染小鼠的HA的特异性TCRTgCD4效应细胞从肺和BAL恢复，并能产生大量的IFN－γ，但不能检测到Th2细胞因子如IL-4的存在。为了近一步研究CD4抵抗致死剂量流感感染的机制，我们除了用来自亚致死量感染BALB/c　IFN－γ-/-小鼠的多克隆CD4效应细胞，还用了来自缺乏IFN-γ的Tg小鼠的单克隆CD4细胞。表2显示多克隆细胞的保护是依靠IFN-γ，然而通过分离肺细胞发现，肺内保护不需IFN-γ。在一系列实验中，在体外用HA和Th1细胞因子可刺激特异性流感野生型和IFN-γ缺乏TCRTgCD4细胞。这些单克隆随经静脉转入BALB/c小鼠，随后用致死剂量的PR8感染并检测存活下来 的小鼠。令人惊讶的是，IFN-γ对经单克隆、体外刺激的CD4介导的保护是需要的。更进一步研究发现，野生型和IFN-γ缺乏在体外产生的效应器都是细胞毒性的，这就证明在体内的保护另有其他机制。我们考虑用一种可能性来技术这些发现，即在体内产生的效应器可能 不是细胞毒的，大多依靠IFN-γ发挥效应功能，而在体外产生的效应器通过高的CTL能力可弥补IFN-γ的缺乏。在另一相似的研究中，也证实分离自BAL的特异性仙台病毒记忆性CD4细胞转入新生小鼠体内可降低仙台病毒感染的病毒滴度。不知道在体内是否有这些效应细胞和直接的细胞毒性，也不知道它们吸引其他宿主细胞到感染部位是由于快速表达的细胞因子和化学因子，或是联合机制的保护作用。 。
病毒清除和组织损伤之间的平衡在许多情况下引起了免疫病理。这已在流感免疫应答中被证实了，不能分泌IFN-γ的CD8效应细胞比有能力分泌IFN-γ的Tc1效应器引起更大的肺损害。同样，在慢性LCMV感染的CD8细胞在IFN-γ缺乏，CD4衰竭的小鼠导致wasting disease。这就说明通过CD8细胞分泌的IFN－γ能在肺或其他器官的免疫损伤中发挥保护作用。的确，由Tc1　IFN-γ-/- 和 Tc2　IFN-γ-/- 效应细胞引起的损害包括嗜酸性细胞增多和坏死性损害的增加。还不知道在流感感染后有多大范围的CD4细胞参与了肺的免疫病理，然而已经知道Th2细胞不能对抗致死量的流感感染，原因可能是由于2型细胞因子引起病理增加，IL-4,IL-5引起嗜酸性细胞增多。近来，已发现阻断OX40-OX40L共刺激途径能导致进入肺的T细胞减少，及在流感感染后减轻免疫病理。还需要证明的是在更强致病力的流感菌株感染后，CD4和CD8细胞是否同等的引起了免疫病理。另外，还不知道特异流感CD4细胞定居在肺实质的哪个部位，及在肺内还有其他什么类型的相关细胞。如果CD4的主要作用是帮助产生抗体应答，那为什么在肺和BAL中有大量的有活性的CD4效应细胞呢？
8.流感的记忆性CD4应答
用多聚体技术已证实CD4细胞的减少阶段比CD8显著，导致CD4细胞在LCMV和仙台病毒感染的记忆期下降。追踪流感感染记忆期的CD4细胞在技术上有困难，因为低数量的CD4细胞一直持续到记忆期，缺乏检测低频率细胞的有效试剂。在我们的研究中采用过继转移系统，我们可以在LCMV和仙台病毒感染的相似模式上观察。特别是流感相关CD4细胞和感染部位即肺实质特异流感CD8细胞相比，显示出减少期延长。另外，在非淋巴部位（肺和BAL）CD4细胞频率在记忆期持续低于CD8细胞频率，有趣的是，在淋巴部位（脾脏和淋巴结）记忆期的CD4细胞频率接近于CD8细胞频率。
流感的初次CD4应答是一包括多种效应细胞的混合体，当淋巴器官内的CD4效应细胞分化少，主要产生IL－2时，肺内和BAL内的效应细胞显示了更活跃的表型。病毒清除后，代表所有分化阶段的效应细胞能使相应的异质性记忆群升高。在淋巴结和脾脏发现的CD4记忆细胞证实表达高水平的CD62L和CCR7，而在感染后30多天在肺内发现的CD4记忆细胞是小的静止细胞，表达低水平的CD62L和CCR7及高水平CD43。在不同器官产生的异质性记忆亚群显示功能性的CD4记忆群的差别是基于不同的解剖部位。对仙台病毒的记忆性CD4应答也是异质性的。显性的标志如CD43和CD11a在肺实质中四聚物阳性细胞的表达和在气道中的表达是有差别的，另外，肺内的tet+细胞和淋巴结中的细胞相比证实有高的有活性的显型。这些数据显示存在着复杂的，不同的CD4记忆细胞亚群，这些细胞可能功能不同。尤其是肺内的CD4记忆细胞对呼吸道内的再次感染应答是无作用的，而淋巴器官内的CD4细胞在应答后能恢复。这些研究有趣的一个方面是在肺内的CD4记忆细胞比周边的细胞衰变快，这对疫苗的发展是一重要暗示，我们实验室正在研究CD4记忆亚群的功能。
9.摘要和结束评论
CD4细胞在局部和系统性感染的抗病毒应答中是一重要组成部分。尽管早期用CD4衰竭的小鼠的研究显示CD4细胞在初次应答中不是绝对需要的，但近来更多的研究已证明CD4细胞对长期的、持续的、有效的CD8记忆是必需的。另外，CD4应答包括扩增、分化和迁移到感染部位，尽管对流感感染的初次CD4T细胞应答在数量上不如CD8应答。CD4效应细胞也能提高致死剂量流感病毒感染的存活率，可能是由于免疫介导的病理。最后，在初次应答中观察到的CD4群的异质性在感染清除后的记忆期又重现了。因此，我们认为CD4效应T细胞对流感的免疫可能是多种机制引起的，这一点正开始受到重视，这些机制可能包括在特异流感CD8CTL的产生和B细胞产生抗体中的辅助作用，也有可能是CD4效应细胞在肺内依靠IFN－γ和/或对感染细胞直接的细胞溶解效应来直接参与了病毒清除。