活细胞免疫荧光技术——流式细胞仪标本的制备

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原理

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

材料与仪器

细胞悬液

羊抗鼠荧光标记物、DPBS、洗涤液、固定液、甲醛、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾

玻璃管、离心管、荧光显微镜、离心机

步骤

制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)

↓

用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为5x106～1x107／ml

 ↓

取40ul细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50ul)的小玻璃管或塑料离心管，再加50ul 1∶20(用DPBS

稀释)灭活正常兔血清

↓4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpmx5min

↓

弃上清，加入50ul工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇

↓　4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmx5min

↓

加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，

视细胞浓度加入100～500ul固定液)

↓

FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)

注意事项

1、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

常见问题

流式细胞仪的特征：

1. 灵敏度高 ；

2. 速度快；

3. 多参数分析（可同时标记多种荧光素）；

4. 单细胞水平上的分析；

5. 需要样本量少；

6. 出结果快；

7.标本来源广。

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