protocol 分享｜细胞免疫荧光（IF）超全步骤

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（每周更新防走丢～）

一、材料

【样品】贴壁细胞

【试剂】4%组织固定液，PBS，Triton X-100、BSA、荧光二抗、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光猝灭封片液，0.25%胰酶。

【器材】6/12/24孔板，细胞爬片（盖玻片），载玻片，15ml离心管。

二、步骤

【实验前准备】

配置10% 封闭液； 0.2% Triton X-100；

第一天：

1.取普通洁净盖玻片于75% 乙醇浸泡，无菌超净台内吹干，将玻片置于 6/12/24 孔板内，种入细胞培养液过夜，使约为 30%-60% 满。

2.按照特定的实验目的处理细胞后，吸尽培养液，用 2/1/0.5 ml PBS洗两次，加入1/0.5/0.25 ml 固定液，室温固定 15 min。

3.去除固定液，用 PBS 润洗 3 次，每次 5 min，摇床轻摇。

4.用 0.2% Triton X-100 室温通透5min，PBS 润洗 3 次，每次 5 min，摇床轻摇。

5.用封闭液（2/1/0.5ml/孔）封闭 60 min。

6.吸去封闭液（勿洗），用一抗（1/0.5/0.25ml/孔）作用 60 min或4℃ 过夜，摇床轻摇。

【第二天】

7.去除一抗，PBS 润洗 3 次，每次 5 min，摇床轻摇。

8.弃 PBS，加入1/0.5/0.25 ml/孔稀释的荧光二抗，室温避光孵育 40 min，摇床轻摇。

9.回收荧光二抗，PBS润洗 3 次，每次 5 min，摇床轻摇。

10.滴加 DAPI（200/100/50ul/孔）避光孵育 5 min，PBS 润洗 4 次，每次 5 min，洗去多余的 DAPI。

用滤纸吸干爬片上的液体，滴1滴抗荧光猝灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，避免气泡，使细胞接触封片液，荧光显微镜观察绿色荧光。

三、常见问题

1、信号弱或者无信号：

1）细胞或组织样本保存时间过长；2）抗体浓度不合适，参照抗体说明书的稀释浓度，再根据样本表达量进行摸索；3）一抗孵育时间不合适，建议4℃ 过夜孵育。

2、高背景：

1）封闭不充分；2）抗体浓度过高；3）抗体孵育时间过长或温度过高；4）清洗不充分；5）样本变干，染色过程确保样品始终浸没于液体环境中

3、非特异性染色较多：

1）固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色；

2）二抗残留，二抗需要用带有吐温20 的 PBS 溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。

参考来源：RIM32 Deficiency Impairs Synaptic Plasticity by Excitatory-Inhibitory Imbalance via Notch Pathway.

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