【求助】表达质粒和目的片段双酶切后，一直连不上，为什么？
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大家好，我最近一直在做表达载体、目的片段的双酶切和酶连、转化。但是转化后的平班上长出来的菌落全部是假阳性的，一个板子能长10-30个菌落，但是做菌液PCR后全部是假阳性。做了好长时间了，一直是这样，不知道什么原因了！还望大家给予指点，小妹在此不胜感激！！！！！！
内切酶和T4连接酶都是购买的TaKaRa的产品。
我用的两个内切酶是EcoRI和XhoI，内切酶是没有问题的，我已经做了单酶切试验了，都能把pET-28a和pGEX-4T-1这两个表达载体切开（由于不知道那种载体能将蛋白表达，所以同时用了2个表达载体）。
我加抗生素的时候都是在LB培养基的温度为50读左右的时候加的。Amp的终浓度是50ng/ul，Kan的终浓度是50ug/ml。
我的酶切体系20ul：EcoRI 1ul，XhoI 1ul，10*H Buffer 2ul，质粒DNA/目的片段 16ul；37度酶切4h。双酶切产物进行柱式胶回收纯化，然后进行连接。
酶连体系10ul：T4连接Buffer 1ul，DNA 3ul，载体DNA 5ul，T4连接酶 1ul；我是按照p摩尔比（DNA：载体DNA=10:1进行的连接）；连接条件是4杜连接过夜（20h左右）。纯化后的载体DNA浓度为5ng/ul，DNA浓度为40ng/ul。
将以上的连接产物进行转化实验，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，最后平板上长出来的菌落全部是假阳性的！
我的目的片段是1.9kp，目的片段直接用PCR纯化产物进行双酶切，表达载体提取质粒后进行双酶切，然后进行的酶连以及后续试验。
内切酶和T4连接酶都是购买的TaKaRa的产品。
我用的两个内切酶是EcoRI和XhoI，内切酶是没有问题的，我已经做了单酶切试验了，都能把pET-28a和pGEX-4T-1这两个表达载体切开（由于不知道那种载体能将蛋白表达，所以同时用了2个表达载体）。
我加抗生素的时候都是在LB培养基的温度为50读左右的时候加的。Amp的终浓度是50ng/ul，Kan的终浓度是50ug/ml。
我的酶切体系20ul：EcoRI 1ul，XhoI 1ul，10*H Buffer 2ul，质粒DNA/目的片段 16ul；37度酶切4h。双酶切产物进行柱式胶回收纯化，然后进行连接。
酶连体系10ul：T4连接Buffer 1ul，DNA 3ul，载体DNA 5ul，T4连接酶 1ul；我是按照p摩尔比（DNA：载体DNA=10:1进行的连接）；连接条件是4杜连接过夜（20h左右）。纯化后的载体DNA浓度为5ng/ul，DNA浓度为40ng/ul。
将以上的连接产物进行转化实验，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，最后平板上长出来的菌落全部是假阳性的！
我的目的片段是1.9kp，目的片段直接用PCR纯化产物进行双酶切，表达载体提取质粒后进行双酶切，然后进行的酶连以及后续试验。
