【求助】PVDF膜上蛋白条带全部曝光，着急！

请有经验的园友诊断一下。昨天晚上和今天晚上曝光两次，目的蛋白似乎有出现，很淡，很细，PVDF膜上的其他非特异蛋白条带也全部曝光，是怎么回事啊？
我的试验参数如下：
1、8%的分离胶 电泳时间（浓缩80V+分离胶110V 大概100min）；
2、转移参数：转移液 新鲜配制
恒流 300mA 时间320min
3、封闭：10%脱脂奶粉 1H
4、一抗：1：500 孵育过夜后，室温摇床孵育2小时
5、二抗：1：10000 室温孵育3H
6、一抗、二抗的洗涤时间 皆是15min*3次

有人建议从以下三方面来改进：
1、采用10%的脱脂奶粉作为封闭液得提前三小时配制，以免封闭时未溶的蛋白颗粒影响结合；
2、降低一抗的孵育浓度，延长孵育时间
请问园友们 哪些步骤需要改进啊 接下来如何摸索。。。