CRISRP-Cas9靶基因敲除编辑-第二讲之sgRAN克隆连接至质粒骨架
第一讲中,设计好的sgRNA,接下来就需要连接到质粒上,然后进行转化挑单克隆,进行Sanger测序确认sgRNA序列正确连接到质粒骨架上. 那么,怎么把设计好的sgRNA公司合成后,连接到CRISPR-Cas9质粒上呢?具体实验步骤第一步:BsmBI酶切慢病毒CRISPR质粒骨架质粒骨架:addgene #83480或者#52961以83480为例,质粒骨架:图1 lentiCRISPR v2质粒图谱表1 酶切体系(备注:反应液配制完成后,充分混匀在37°C, 孵育30分钟)第二步: 0.8-1% Agarose gel电泳线性化CRISPR质粒骨架,切胶回收.目标片段为约12kb左右.第三步