CRISRP-Cas9靶基因敲除编辑-第二讲之sgRAN克隆连接至质粒骨架

第一讲中,设计好的sgRNA,接下来就需要连接到质粒上,然后进行转化挑单克隆,进行Sanger测序确认sgRNA序列正确连接到质粒骨架上. 那么,怎么把设计好的sgRNA公司合成后,连接到CRISPR-Cas9质粒上呢?
具体实验步骤
第一步:BsmBI酶切慢病毒CRISPR质粒骨架
质粒骨架:addgene #83480或者#52961
以83480为例,质粒骨架:

图1 lentiCRISPR v2质粒图谱
表1 酶切体系

(备注:反应液配制完成后,充分混匀在37°C, 孵育30分钟)
第二步: 0.8-1% Agarose gel电泳线性化CRISPR质粒骨架,切胶回收.目标片段为约12kb左右.

第三步:合成的sgRNA oligo进行退火
比如上一讲设计的TP53 sgRNAs,公司直接合成
Oligo1 : 5‘—caccgCGCTATCTGAGCAGCGCTCA –3’
Oligo 2: 5‘—aaacTGAGCGCTGCTCAGATAGCGc—3’
表2 退火体系

(备注:配置好的退货体系,PCR仪完成以下程序)
表3 退火程序


(备注:退火完成后,寡核苷酸链即可形成配对,待PCR仪完成程序后,1:200稀释,以备后续连接。)
第四步:BsmbI酶切后线性化胶回收的CRISPR骨架质粒及退火好的Oligos即可进行连接反应.
表4 连接反应体系

(备注:室温孵育10分钟,或者根据连接酶推荐的连接反应条件执行)
第五步:完成孵育后,即可在DH5alpha或者其他类型感受态细菌转化.
第六步:转化完成后,涂板,37°C温箱培育12-16h,即可挑单克隆,摇菌送Sanger测序.
爱自己!!!做科研!!! 每文格言思想家塞涅卡曾说一句话:“我们何必为生命的片段而哭泣,我们全部的人生都催人泪下。如果有用,关注楼主GBhouse,点赞+讨论,攻击型人格请请请不要关注和阅读!!!